一种检测尿液Aβ淀粉样蛋白的试纸条及方法与流程

文档序号:22205050发布日期:2020-09-11 23:41
一种检测尿液Aβ淀粉样蛋白的试纸条及方法与流程

本发明涉及一种检测尿液aβ淀粉样蛋白的试纸条及方法。



背景技术:

阿尔茨海默症(ad)是最常见的痴呆症,影响着全世界超过2600万人。我们和其他研究者发现,很大部分(30%)认知正常的老年人表现出大脑中pet配体高保留而脑脊液(csf)则呈现低水平的aβ1-42,这些人目前被诊断分类为临床前潜伏阶段阿尔茨海默症。轻度认知障碍(mci)被认为是ad的前驱阶段,40-60%的符合mci标准的患者会最终发展为临床ad,每年约占5-25%。散发性ad的主要病因是aβ的积累和aβ清除的失败。目前该研究领域内普遍支持“淀粉样蛋白级联假说”,即大脑中aβ的代谢失衡是神经退行性变和ad患者认知能力衰退的根本原因。许多动物和遗传研究表明,单核/巨噬/小神经胶质细胞的先天吞噬作用可能可以通过促进aβ的清除和预防老年斑的形成来推缓ad的发展。

生物标记有希望作为早期诊断阿尔茨海默症的有效手段,包括检测大脑尤其是海马体体积的减少(通过核磁共振检测手段(mri)),检测大脑功能的改变(使用功能性核磁共振成像)以及脑脊液(csf)中aβ1-40、aβ1-42和tau的浓度改变。然而,后一种手段是侵入性的,病人的依从性很低。另一种可期待的方法是配位正电子发射断层扫描成像(pet)3。神经成像(mri、pet、ct)既昂贵且可供临床使用的设施数量不足以满足人群筛查的需求量。尽管研究表明,血浆aβ1-42/aβ1-40的比例可以作为一个识别潜在高危mci或ad患者的有效的生物标志物,但是,该检测需要特殊仪器并且不适合人群普筛。因此,现在我们迫切需要更实用、更灵敏、更特异性的全新ad生物标志物。

ad是一种全身系统性疾病,而不仅仅是大脑的紊乱和损伤。在尿液中已经发现血浆可溶性aβ可被滤出排出体外,这可能可以反映aβ在大脑流通中的变化。由于人尿液中aβ浓度极低值低于elisa检测方法的检测临界限,目前并没有任何针对尿液aβ目标来诊断mci或ad的临床常规诊断程序。目标抗原太小,仅有4.3kd,且容易与其他蛋白发生非特异性结合,因此惯常用的“双抗夹心法”或“竞争法”难以达到较高的灵敏度和特异性。



技术实现要素:

本发明旨在克服现有技术的不足,提供一种检测尿液aβ淀粉样蛋白的试纸条及方法。

为了达到上述目的,本发明提供的技术方案为:

所述检测尿液aβ淀粉样蛋白的试纸条包括pvc底板(7),所述pvc底板(7)上铺设有依次搭接的样品垫(1)、共轭结合垫(2)、层析垫(3)和吸水垫(4);所述共轭结合垫(2)上涂有与单克隆抗体共轭结合的胶体金颗粒;所述层析垫(3)上靠近共轭结合垫(2)的一侧设有检测线(5)、靠近吸水垫(4)的一侧设有对照控制线(6),所述检测线(5)上涂有aβ淀粉样蛋白结合高聚物,所述对照控制线(6)上涂有羊抗鼠igg多克隆抗体。

优选地,所述由谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、酪氨酸随机合成的小肽链,分子量为4—52kd。

优选地,所述抗aβ单克隆抗体是由鼠杂交瘤细胞系制备的鼠抗aβ单克隆抗体;或者为单克隆抗体1e8、单克隆抗体4g8、单克隆抗体w0-2、单克隆抗体6e10中的至少一种。

优选地,所述样品垫(1)上涂有电泳缓冲液,涂量为10-16μl/cm;所述共轭结合垫(2)上与单克隆抗体共轭结合的胶体金颗粒的涂量为6—9μl/cm;所述检测线(5)上涂布的是aβ淀粉样蛋白结合高聚物浓度为2mg/ml的磷酸盐缓冲液,涂量为1.5-2.5μl/cm;所述对照控制线(6)上涂布的是羊抗鼠igg多克隆抗体浓度为200μg/ml的磷酸盐缓冲液,涂量为1.5-2.5μl/cm。

所述检测尿液aβ淀粉样蛋白的方法是采用粒径为20—50nm的与单克隆抗体共轭结合的胶体金颗粒捕捉尿液中的aβ淀粉样蛋白,形成胶体金颗粒与aβ淀粉样蛋白的复合物,然后用aβ淀粉样蛋白结合高聚物对胶体金颗粒与aβ淀粉样蛋白的复合物进行检测;其中,所述单克隆抗体为抗aβ单克隆抗体;所述aβ淀粉样蛋白结合高聚物为包含由谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、酪氨酸随机合成的小肽链。

优选地,所述小肽链的分子量为4—52kd。

优选地,所述抗aβ单克隆抗体是由鼠杂交瘤细胞系制备的鼠抗aβ单克隆抗体;或者为单克隆抗体1e8、单克隆抗体4g8、单克隆抗体w0-2、单克隆抗体6e10中的至少一种。

所述aβ淀粉样蛋白结合高聚物可用于制备aβ淀粉样蛋白检测试剂、mci诊断试剂、ad诊断试剂。

下面对本发明作进一步说明:

本发明采用粒径为20—40nm的与单克隆抗体共轭结合的胶体金颗粒捕捉尿液中的aβ淀粉样蛋白,形成胶体金颗粒与aβ淀粉样蛋白的复合物。有一种吞噬作用促进肽组群(aβ淀粉样蛋白结合高聚物,命名为ppp),我们了解到其包含有某些聚合物和少数15单体肽,我们发现该组群对aβ1-42富有高亲和力。其中一种聚合物是包含的含有谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸和酪氨酸的随机合成的小肽链,分子量为4-52kd(平均6.5kd)。新鲜溶解的aβ1-42和陈旧aβ1-42的平衡离解常数kd分别为6.6和25.4nm。该聚合物极有希望应用在检测aβ1-42上,甚至可促进人体aβ的清除。因此,我们再用aβ淀粉样蛋白结合高聚物对胶体金颗粒与aβ淀粉样蛋白的复合物进行检测,灵敏度高,检测限为40皮克(pg)。整个免疫层析反应集成在横流层析试纸条系统中,快速、经济、适用于常规临床病理检查、适用于大量人群普筛和家庭终端用户自筛,尤其是用于临床上辅助轻度认知障碍(mci)的早期诊断和预先判断,且预示判断患者是否具有发展为mci和ad高危风险。

附图说明

图1:检测尿液aβ淀粉样蛋白的试纸条结构示意图;图中:1、样品垫;2、共轭结合垫;3、层析垫;4、吸水垫;5、检测线;6、对照控制线;7、pvc底板。

图2:ppp直接绑定结合aβ1-42,具有高亲和力:hilytefluor488标记aβ1-42(加入到pbs中最终为80nm)连续阶梯1:1(体积)稀释混合ppp。采用95%led和40%红外激光功率,在nt.115系统的标准处理毛细管中进行测量;

图3:aβ1-42与ppp的相互作用:a:aβ的二级结构(0.2mg/ml,44μm)通过环状二色光谱(cd)帮助下得以确定;b:ppp(44μm)的二级结构。c.跳跃状态下确定aβ和ppp的结构;运用计算机程序cdsstr和sreerama等人编写的参考数据集3对二级结构分量进行了分析;

图4:ppp与aβ42紧密结合:aβ42(每个10μg,2.2nmol)混合不同量的ppp,0,0.22,1.1,2.2,6.6,15.4nmol(1-6号柱图)或血清集2.2nmol(7号柱图)。混合物(30μl每个样)用50μmdtt稀释减少,在90℃下加热5分钟,加入sds-page(4-12%nupage凝胶,mes缓冲液,100v50分钟);转移蛋白质并用抗-aβ单克隆抗体(克隆w0-2)探测;a:西点免疫印迹图像示aβ染色,每道半定量4.5kd的aβ42单体显示底条;b:蛋白转移到硝化纤维膜后进行ponceaus染色,大量的ppp和牛血清白蛋白(bsa)被染成红色,用seeblue+2标准预染色估计蛋白大小;

图5:纯水配制添加100μl合成aβ42至不同浓度,使终浓度为0-5ng/ml的aβ试纸测试结果(左图);用尿液配制同样100μl合成aβ42的试纸测试结果(右图);

图6:用我们的aβ试纸收集检测了健康儿童的尿样,每个试纸均滴加100μl尿样;

图7:临床样本检测示例。

图2至图7均为本发明实施例中的结果图。

具体实施方式

1、抗aβ单克隆抗体的生产与提纯

采购产自艾比玛特医药科技有限公司(ab-martptyltd)的商用鼠杂交瘤细胞系(bgm02)来生产鼠抗-aβ单克隆抗体,其他可商用单克隆抗体克隆包括1e8、4g8、w0-2、6e10等也可单独或混合使用。采用透气疏水细胞培养瓶,在45℃解冻杂交瘤细胞,并添加1%谷氨酰胺、1%链霉素/青霉素、20%胎牛血清(fbs)的到杂交瘤细胞无血清培养基中(%是指该组分在杂交瘤细胞无血清培养基中的质量百分比)。

当培养基变黄时进行传代细胞,血清在传代细胞的比例从20%、10%、5%、2%下降到无血清培养基中(0%)细胞可存活。这过程通常需要一个月。血清消耗完之前切勿吸取上清液。

在生物反应器中接种培养基时,离心沉淀细胞并倾倒聚集,收集到注射器中后接种培养基。将杂交瘤细胞在生物反应器中的无血清培养基中培养,于10—15d后收取细胞培养上清液。

用结合树脂重组蛋白a通过亲和色谱法纯化抗体。

用1nnaoh或1nhcl将杂交瘤细胞培养上清液调至ph7.5。使用台式离心机以3600转/分钟转速离心20min,或使用高速离心机以7500r/min转速离心10min(首选),以去除所有细胞残骸和析出沉淀物。

将上清液装入到重组蛋白a高流柱中。可选用0.22μm预滤器或配玻璃纤维膜的前置过滤器。保持落地速度低于2ml/min。用至少50mlpbs缓冲液洗涤柱体。

用50ml的40mm柠檬酸三钠(ph3.0)洗脱(速度为1ml/min),用馏分收集器收集洗脱液。使用na2hpo3缓冲液(0.5m,ph9.5)立即中和所有收集物。洗脱后立即冲洗柱。将装好抗体的离心管拉在一起,用a280/a260吸光度分光光度计或蛋白检测试剂盒测定浓度。分装抗体并在-80℃环境下保存。

2、制备30nm胶体金颗粒

取0.01%haucl4溶液200ml,缓慢搅匀煮沸。继续烧开2min,转高速搅拌,立即快速加入1%柠檬酸三钠2.0ml。继续煮沸至溶液变成红色/紫色,之后继续煮沸5min。电子显微镜下检查,预期的颗粒大小为30nm。大小可由1%柠檬酸三钠的体积调节,8.0、6.0、4.0或1.5ml的体积分别产生10、15、20、50nm大小的颗粒。

冷却到室温,用0.1mk2co3将ph值调整到7.2。在10000g转速下离心30min,无制动,去上清液直至剩约20ml,4℃下保存。

3、胶体金颗粒与单克隆抗体的共轭偶联

增加100μl5mm的硼酸缓冲液(ph值9.0)到1—10号管中,添加100μl抗体溶液到管1,混匀,然后依次比例稀释知道到管9,仅在管10中添加100μl硼酸缓冲。添加100μl胶体金溶液(0.1mk2co3调整ph值到9.0)到每支试管中。混匀并培养10分钟。添加10μl10%氯化钠,混匀,静置60-120分钟。如若蛋白质含量充足,则颜色不变,如果蛋白质含量不够,管10中的颜色会变成深蓝色。使用此方法可以找到20ml胶体金颗粒所需的最低蛋白量(xmin)。

胶体金颗粒溶液(用0.1mk2co3调节至ph9.0)中加入在xmin基础上增加10%的量的抗体(5mm硼酸盐缓冲液中ph9.0)。室温下于摇床上放置15min。

通过添加5μl10%到50μl已标记好的胶体金中来检查饱和程度。静置30min。如果胶体金未变色未蓝色并析出金,则已饱和标记好。

加入1%聚乙二醇peg(20kd,用1%柠檬酸三钠或0.1mk2co3调节至ph7.2),使最终浓度为0.1%。

260g低速离心20min,留上清液,去除杂质(小粒)。

10000g高速离心30min,无制动,添加0.2%peg到4mm磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液(ph6.8)至10ml,重悬颗粒,4℃保存。使用前加入10%的蔗糖。

4、横流层析试纸条的装配

参见图1,所述检测尿液aβ淀粉样蛋白的试纸条包括pvc底板7,所述pvc底板7上铺设有依次搭接的样品垫1、共轭结合垫2、层析垫3和吸水垫4;所述共轭结合垫2上涂有与单克隆抗体共轭结合的胶体金颗粒;所述层析垫3上靠近共轭结合垫2的一侧设有检测线5、靠近吸水垫4的一侧设有对照控制线6,所述检测线5上涂有aβ淀粉样蛋白结合高聚物,所述对照控制线6上涂有羊抗鼠igg多克隆抗体。

具体装配过程如下:

样品垫和共轭结合垫在4℃下浸泡在封闭缓冲液(20mm四硼酸钠、ph8.0、2%牛血清白蛋白(bsa)和0.05%nan3)中3h或过夜。衬垫在室温下用蒸馏水(或超纯水)清洗一次,15min,然后在37℃下干燥。

样品垫裁剪到15mm宽的长条,用电泳缓冲液(20mm四硼酸钠,ph8.0,8%bsa,0.05%tween-20,0.05%nan3)喷涂,涂量为10μl/cm。

将共轭结合垫剪切成10mm宽的长条。标记好的胶体金喷涂在共轭结合垫上,涂量为每厘米6—9μl。

层析垫(硝化纤维素膜)上划两根8mm间距的线,检测线和对照控制线。测试线为2mg/ml的含聚合物ppp的10mm磷酸盐缓冲液(pbs),涂量为2.5μl/cm;对照控制线则包含羊抗鼠igg多克隆抗体,加入pbs中至500μg/ml,涂量为2.5μl/cm。每条线均为宽1mm,长4mm。

吸收垫被裁剪为15mm宽的长条。

将上述组件组装成到一个60×300mm的底板上,并裁剪为75条4mm宽的长条。每个试纸条均组装到塑料外壳中。

5、检测尿液aβ横流层析试纸条的使用

在一天中的任何时间内均可采集尿液样本,但最好在同一天进行测量。可在-80℃下鲜冻尿液样本,但不可反复冻融。

在试剂盒外壳的加样口缓慢逐滴加100μl尿样。静置等待20min后,检查检测线和对照控制线。

结果的最佳读取时间是在2h以内,由胶体金免疫层析分析仪读取或目视读取。

结果评判:

阴性(-):仅显色对照控制线

弱阳性(+/-):检测线显色很淡,而对照控制线显色清晰

阳性(+):检测线显色,且显色强度与对照控制线一致

强阳性(++):检测线显色清晰明显,对照控制线则显色正常或稍淡

极强阳性(+++):检测线显色清晰深刻,对照控制线显色极淡或可能不显色。

6、识别aβ聚合物

检测了ppp能否与aβ作用。使用nanotemperor的微量热泳(mst)来确定ppp和aβ1-42之间的亲和力。用hilytefluor488标记aβ1-42(pbs缓冲液中,80nm),1:1(体积)连续稀释ppp,平均分子量为6.5kd。在monolithnt.115系统下用95%led和40%红外激光功率,标准处理毛细管中进行测量。结果表明,分子量为6.6nm时,ppp和aβ1-42之间具有高亲和力结合。ppp对aβ1-42单体的化学计量比为3。即使是把aβ1-42置于4℃环境下一周,析出了更多的低聚物和纤维结构,kd分子量有效值仍然低至25.4nm(图2),相近于aβ单克隆抗体的亲和力。

色谱(cd)光谱学是研究溶液中肽-肽相互作用的一种实用方法。远紫外区(178-260nm)的cd源于蛋白质骨架的酰胺,对蛋白质的构象敏感。因此,cd可以确定多肽在相互作用时构象是否发生变化。cd光谱可用于检测并获取aβ1-42和ppp的结果(图3)。cd是定量分析技术,aβ1-42和ppp相互作用一旦发生,cd谱的变化量则与其形成的肽-肽复合物成正比。结果表明β-折叠结构优先构成于aβ1-42中,而ppp中却不太明显。这种复合物表现出一种明显不同的结构,这表明了aβ1-42和ppp之间存在相互影响(图3)。

进一步使用西点免疫印迹法研究了aβ1-42与ppp之间的交互作用。合成aβ1-42是与不同数量的ppp不同比例混合,而后混合物进行sds-page简化电泳。用减小电泳剂量的方式可以发现,ppp显著保留aβ1-42,即便是递减简化条件下也是这个结果(图4),表明aβ1-42和ppp之间的结合紧密。

因此,不同于传统的多克隆抗体横流免疫色谱法,我们使用的以ppp作为捕获分子检测绑定到共轭胶体金颗粒的aβ。与elisa法相比,该方法极大提高了检测灵敏度。

7、检测尿液aβ横流层析试纸条的临床应用

首先用100μlmilliq超纯水配制的不同浓度的合成aβ42,从0—100ng/ml,依次用试纸检测。结果显示,0—5ng/ml之间有很好的相关性,而高浓度结果并没有进一步表现增加t线的强度,这可能是由于抗原过多所致(图5)。

然后将aβ42添加到阴性尿液样本中并用试纸检测。结果与超纯水配制的aβ42检测试纸结果一致。当用0.5—5ng/ml的aβ42尿液检测时,显现t线,而过量的抗原(10μg/ml)也同样不表现正比递增检测结果(图5)。

用10岁以下健康儿童的尿样测试了本发明的试纸条(图6)。超过90%的健康儿童尿液样本检测结果呈阴性。

用152名中国汉族人的尿样测试了这些试纸(图7)。研究对象为位于中国上海的复旦大学华山医院神经内科招募的门诊患者。其中男性55例,平均年龄68.5岁,女性97例,平均年龄68.1岁。年龄跨度从42岁到89岁,平均68.3岁。

对象包括:

(1)认知正常对照组(n=30):无已知年龄相关疾病,简易精神状态评价量表检查(mmse)得分不低于27分;这组患者中有22人在门诊抱怨近期有记忆力减退。其他8人是患者家属。

(2)mci组(n=47):临床评价(mmse评分22-30),包括早期ad患者。

(3)轻度ad组(n=37):mmse评分10-20

(4)重度ad组(n=6):mmse<10。

(5)其他痴呆(n=21):包括15个血管性痴呆,3个额颞叶痴呆,3个刘易斯体痴呆。

(6)帕金森患者(n=3)。

所有尿样均进行常规尿检。排除高蛋白(2+或以上)尿。

总体结果(表1)显示,mci和早期/轻度ad的检出率较高,同时伴有其他痴呆,表明这些条带在临床诊断mci和ad方面具有较高的潜力。

表1:aβ试纸检测结果

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