稳定的杀真菌组合物的制作方法

文档序号:24062385发布日期:2021-02-26 18:30
稳定的杀真菌组合物的制作方法
稳定的杀真菌组合物
[0001]
相关申请的交叉引用
[0002]
本申请要求于2018年5月17日提交的美国临时专利申请号62/672,969的优先权,其全部内容通过引用的方式并入本文。
技术领域
[0003]
本发明涉及细菌菌株制剂及其用于防治植物病害的方法。具体而言,本发明涉及产生杀镰孢菌素(fusaricidin)的类芽孢杆菌属种(paenibacillus sp.)菌株的稳定的杀真菌组合物和的制剂。


背景技术:

[0004]
杀菌剂具有众多用途,包括用于作物保护;作为食品、饲料和化妆品防腐剂;以及作为人类和兽医应用的治疗剂。在发达国家和发展中国家均存在作物减产、食物传播疾病以及人类和动物的真菌感染的问题。
[0005]
合成杀虫剂或杀真菌剂通常是非特异性的,因此可以作用于靶生物体以外的生物体,包括其他天然存在的有益的生物体。由于它们的化学性质,它们也可能是有毒的和非生物降解的。全世界的消费者越来越意识到与化学品残留有关的潜在环境和健康问题,特别是在食品中。这已经导致针对减少化学(即合成)杀虫剂的使用或至少减少其数量的不断增加的消费者压力。因此,需要管理食物链需求,同时仍然允许有效的害虫防治。
[0006]
另一个随着使用合成杀虫剂或杀真菌剂而出现的问题是,杀虫剂或杀真菌剂的重复和单独施用通常导致选择出抗性病原微生物。通常,这样的菌株还对具有相同作用模式的其他活性成分具有交叉抗性。之后,使用所述活性化合物来有效防治病原体将不再可能。然而,具有新的作用机制的活性成分难以开发并且开发成本昂贵。
[0007]
在病原体种群中抗性发展的风险以及对环境和人类健康的担忧促进了对鉴定用于管理植物病害的合成杀虫剂和杀真菌剂的替代方案的兴趣。生物防治剂的使用是一种替代方案。
[0008]
基于类芽孢杆菌属的生物防治剂可以提供一种有价值的工具以防治植物病害谱,同时降低病原体抗性的风险。在类芽孢杆菌属种菌株的发酵过程中产生杀镰孢菌素和其他抗真菌化合物。然而,这些抗真菌化合物在基于类芽孢杆菌属的生物防治剂的贮存和运输过程中易于降解。生长季节期间常见的温度升高会促进这些抗真菌化合物的降解。需要鉴定稳定的基于类芽孢杆菌属的生物防治剂的组合物和制剂,其在升高的温度下将长期保持其防治植物病害的活性。


技术实现要素:

[0009]
本发明基于鉴定抑制由类芽孢杆菌属种菌株产生的抗真菌化合物的降解的稳定剂。这些稳定剂保留了配制的类芽孢杆菌属种菌株的抗真菌活性并且减少了杀镰孢菌素和杀镰孢菌素样化合物的分解。
[0010]
在某些实施方案中,本发明涉及稳定的杀真菌组合物,其包含:a)产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株;以及b)稳定剂,其选自胺、季铵化合物、磷酸盐或柠檬酸盐、具有2至10个碳原子的短链多元醇、脲及其组合。
[0011]
在其他实施方案中,本发明涉及稳定的杀真菌组合物,其包含:a)产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株;以及b)稳定剂,其选自胺、季铵化合物、磷酸盐或柠檬酸盐、具有2至10个碳原子的短链多元醇、脲、链烷醇胺、酰胺及其组合。
[0012]
在一些实施方案中,本发明涉及稳定的杀真菌组合物,其包含:a)产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株;以及b)稳定剂,其选自碳酰二胺(co(nh2)2)、盐酸胍、三乙醇胺、甜菜碱盐酸盐、磷酸钾(二元的)、柠檬酸钾(三元的)及其组合。
[0013]
在某些方面,所述组合物或制剂包含产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株的生物纯培养物。
[0014]
在一个实施方案中,产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株是:吃琼脂类芽孢杆菌(p.agarexedens)、嗜琼胶类芽孢杆菌(p.agaridevorans)、解藻酸类芽孢杆菌(p.alginolyticus)、居冷泉类芽孢杆菌(p.alkaliterrae)、蜂房类芽孢杆菌(p.alvei)、解淀粉类芽孢杆菌(p.amylolyticus)、厌氧生长类芽孢杆菌(p.anaericanus)、南极类芽孢杆菌(p.antarcticus)、阿萨姆类芽孢杆菌(p.assamensis)、氮还原类芽孢杆菌(p.azoreducens)、固氮类芽孢杆菌(p.azotofixans)、巴塞罗那类芽孢杆菌(p.barcinonensis)、北风类芽孢杆菌(p.borealis)、巴西类芽孢杆菌(p.brasiliensis)、p.brassicae、坎皮纳斯类芽孢杆菌(p.campinasensis)、晋州类芽孢杆菌(p.chinjuensis)、解几丁质类芽孢杆菌(p.chitinolyticus)、软骨素类芽孢杆菌(p.chondroitinus)、p.cineris、库氏类芽孢杆菌(p.cookie)、解凝乳类芽孢杆菌(p.curdlanolyticus)、内类芽孢杆菌(p.daejeonensis)、树形类芽孢杆菌(p.dendritiformis)、坚韧类芽孢杆菌(p.durum)、爱媛类芽孢杆菌(p.ehimensis)、埃吉类芽孢杆菌(p.elgii)、蜜梳状孢类芽孢杆菌(p.favisporus)、解葡聚糖类芽孢杆菌(p.glucanolyticus)、解聚糖类芽孢杆菌(p.glycanilyticus)、戈氏类芽孢杆菌(p.gordonae)、草类芽孢杆菌(p.graminis)、食颗粒类芽孢杆菌(p.granivorans)、p.hodogayensis、依利诺斯类芽孢杆菌(p.illinoisensis)、加米那类芽孢杆菌(p.jamilae)、神户类芽孢杆菌(p.kobensis)、食鞘类芽孢杆菌(p.koleovorans)、韩国类芽孢杆菌(p.koreensis)、胶冻样类芽孢杆菌(p.kribbensis)、乳类芽孢杆菌(p.lactis)、幼虫类芽孢杆菌(p.larvae)、灿烂类芽孢杆菌(p.lautus)、p.lentimorbus、浸麻类芽孢杆菌(p.macerans)、马阔里类芽孢杆菌(p.macquariensis)、马赛类芽孢杆菌(p.massiliensis)、孟氏类芽孢杆菌(p.mendelii)、本部类芽孢杆菌(p.motobuensis)、食萘类芽孢杆菌(p.naphthalenovorans)、嗜线虫类芽孢杆菌(p.nematophilus)、类芽孢杆菌附生新种(p.nov.spec.epiphyticus)、异味类芽胞杆菌(p.odorifer)、饲料类芽孢杆菌(p.pabuli)、皮尔瑞俄类芽孢杆菌(p.peoriae)、p.phoenicis、叶际类芽孢杆菌(p.phyllosphaerae)、多粘类芽孢杆菌(p.polymyxa)、多粘类芽孢杆菌多粘亚种(p.polymyxa ssp.polymyxa)、多粘类芽孢杆菌植物亚种(p.polymyxa ssp.plantarum)、日本类芽孢杆菌(p.popilliae)、尘埃类芽孢杆菌(p.pulvifaciens)、根际类芽孢杆菌(p.rhizosphaerae)、血类芽孢杆菌(p.sanguinis)、星孢类芽孢杆菌(p.stellifer)、台中
类芽孢杆菌(p.taichungensis)、土地类芽孢杆菌(p.terrae)、解硫胺素类芽孢杆菌(p.thiaminolyticus)、提蒙类芽孢杆菌(p.timonensis)、p.tylopili、苏黎士类芽孢杆菌(p.turicensis)、强壮类芽孢杆菌(p.validus)、旋涡状类芽孢杆菌(p.vortex)、伤口类芽孢杆菌(p.vulneris)、温类芽孢杆菌(p.wynnii)或解木聚糖类芽孢杆菌(p.xylanilyticus)。
[0015]
在另一个实施方案中,产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株是:多粘类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌多粘亚种、多粘类芽孢杆菌植物亚种、类芽孢杆菌附生新种、土地类芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌或蜂房类芽孢杆菌。在又一个实施方案中,产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株是土地类芽孢杆菌。
[0016]
杀真菌组合物可以是任何制剂形式,具体而言是液体组合物,例如乳化浓缩物、悬乳剂、悬浮浓缩物或溶液,例如水性溶液。
[0017]
在一些方面,产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株与稳定剂的重量比为约500∶1至约1∶500、约400∶1至约1∶400、约300∶1至约1∶300、约200∶1至约1∶200、约100∶1至约1∶100、约75∶1至约1∶75或约50∶1至约1∶50。在一个实施方案中,产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株与稳定剂的重量比为约200∶1至约1∶200。在另一个实施方案中,产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株与稳定剂的重量比为约50∶1至约1∶50。
[0018]
在某些方面,杀真菌组合物还包含极性与水混溶的有机溶剂。极性与水混溶的有机溶剂可以是以下有机溶剂中的任一种和/或其组合:1,3-丁二醇、2-吡咯烷酮、丙酮、乙腈、脂肪族醇、脂肪族羧酸烷基酯、环己酮、二乙二醇和三乙二醇、二丙酮醇、二烷基酮、二甘醇、二甘醇二甲醚、二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)、乙醇、乙酸乙酯、甲酰胺、糠醇、γ-丁内酯、甘油、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、乙二醇醚、乙二醇、1,6-己二醇(hexamethylene glycol)、异丙醇、甲基乙基酮、n-甲基吡咯烷酮、1,5-戊二醇(pentamethylene glycol)、磷酸酯、聚乙二醇、聚乙二醇类、多羟基化烷烃、丙醇、碳酸丙烯酯、丙二醇、吡咯烷、吡咯烷、环丁砜、四氢呋喃、1,4-丁二醇(tetramethylene glycol)、硫二甘醇、三甘醇。
[0019]
在某些方面,本发明涉及一种组合物,其中产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株是类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67129、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67615或其杀真菌突变菌株。组合物可以包含类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67129、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67615或其杀真菌突变菌株的发酵产物。
[0020]
在一些实施方案中,杀真菌突变菌株的基因组序列与类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67129、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306或类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67615具有大于约90%序列同一性。在其他实施方案中,杀真菌突变菌株具有与类芽孢杆菌属种nrrl b-50972相当或更好的杀真菌活性和/或杀镰孢菌素的水平。
[0021]
在一方面,本发明涉及农业上可接受的稳定的水性制剂,其包含:(a)产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株,其量为3%w/w至90%w/w;(b)稳定剂,其选自胺、季铵化合物、磷酸盐或柠檬酸盐、具有2至10个碳原子的短链多元醇、脲及其组合,其量为0.1%w/w至
10%w/w;(c)水;以及(d)任选地,极性与水混溶的有机溶剂,其量为2%w/w至60%w/w。
[0022]
在另一方面,本发明涉及农业上可接受的稳定的水性制剂,其包含:(a)产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株,其量为3%w/w至90%w/w;(b)稳定剂,其选自碳酰二胺(co(nh2)2)、盐酸胍、三乙醇胺、甜菜碱盐酸盐、磷酸钾(二元的)、柠檬酸钾(三元的)及其组合,其量为0.1%w/w至10%w/w;(c)水;以及(d)任选地,极性与水混溶的有机溶剂,其量为2%w/w至60%w/w。
[0023]
所施用的产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株的量优选为整个制剂的约3%w/w至约90%w/w。更优选地,产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株以以下量存在:约4%至80%w/w,更优选5%w/w至约75%w/w,并且在一些实施方案中,约10%w/w至约70%w/w或甚至约20%w/w至约70%w/w。
[0024]
所施用的稳定剂的量优选为整个制剂的约0.1%w/w至约20%w/w。更优选地,稳定剂以以下量存在:约0.5%至10%w/w,更优选0.5%w/w至约5%w/w,并且在一些实施方案中,约0.5%w/w至约2%w/w。
[0025]
所施用的极性与水混溶的有机溶剂的量任选为整个制剂的约2%w/w至约60%w/w。或者,极性与水混溶的有机溶剂任选以以下量存在:约5%至50%w/w,更优选10%w/w至约40%w/w,并且在一些实施方案中,约20%w/w至约40%w/w。
[0026]
在某些方面,本发明涉及稳定的干燥制剂,其包含:(a)产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株;以及(b)稳定剂,其选自胺、季铵化合物、磷酸盐或柠檬酸盐、具有2至10个碳原子的短链多元醇、脲及其组合。
[0027]
在其他方面,本发明涉及稳定的干燥制剂,其包含:(a)产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株;以及(b)稳定剂,其选自胺、季铵化合物、磷酸盐或柠檬酸盐、具有2至10个碳原子的短链多元醇、脲、链烷醇胺、酰胺及其组合。
[0028]
干燥制剂可以是可湿性粉剂、可溶性粉剂、粉尘(dust)、颗粒剂(granule)、片剂、水溶性和水分散性颗粒剂、水溶性和水分散性片剂,以及水溶性和水分散性粉剂中的任一种。
[0029]
在一个实施方案中,本发明涉及农业上可接受的稳定的制剂,其包含:(a)产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株,其量为3%w/w至90%w/w;(b)稳定剂,其选自胺、季铵化合物、磷酸盐或柠檬酸盐、具有2至10个碳原子的短链多元醇、脲及其组合,其量为0.1%w/w至10%w/w;以及(c)其他惰性制剂。
[0030]
在又一个实施方案中,本发明涉及处理植物以防治病害的方法,其中该方法包括将有效量的本文公开的组合物或制剂施用于植物、植物部分和/或植物所在位置。在某些方面,所述组合物包含类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67129、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67615或其杀真菌突变菌株的发酵产物。在其他方面,该方法包括将组合物施用于叶的植物部分。在又其他方面,以每公顷约1
×
10
10
至约1
×
10
12
菌落形成单位(cfu)的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67129、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67615或其杀真菌突变菌株来施用组合物。在一个实施方案中,以每公顷约0.5kg至约5kg发酵固体来施用组合物。
[0031]
在一些方面,植物病害是由真菌引起的。在其他方面,植物病害是霉病或锈病。在一个实施方案中,霉病是白粉病或霜霉病。在另一个实施方案中,锈病选自小麦叶锈病、大麦叶锈病、黑麦叶锈病、褐叶锈病、冠锈病和茎锈病。
[0032]
在一些实施方案中,所述真菌选自互格交链孢(alternaria alternata)、索兰尼链格孢(alternaria solani)、灰葡萄孢菌(botrytis cinerea)、炭疽毛盘孢(colletotrichum lagenarium)、大刀镰刀菌(fusarium culmorum)、颖枯壳针孢(phaeosphaeria nodorum)、禾生球腔菌(zymoseptoria tritici)、隐地疫霉(phytophthora cryptogea)、致病疫霉(phytophthora infestans)、终极腐霉(pythium ultimum)、稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(thanatephorus cucumeris)、黑粉菌燕麦变种(ustilago segetum var.avenae)、疣顶单孢锈菌(uromyces appendiculatus)和小麦叶锈菌(puccinia triticina)。
[0033]
本发明还涉及所公开的组合物和制剂用于在有用植物中防治植物致病生物体的用途。在某些方面,植物致病生物体选自互格交链孢、索兰尼链格孢、灰葡萄孢菌、炭疽毛盘孢、大刀镰刀菌、颖枯壳针孢、禾生球腔菌、隐地疫霉、致病疫霉、终极腐霉、稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、黑粉菌燕麦变种、疣顶单孢锈菌和小麦叶锈菌。在其他方面,所述植物致病生物体选自野油菜黄单胞菌(xanthomonas campestris)、丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)和胡萝卜软腐欧文氏菌(erwinia carotovora)。
[0034]
在其他方面,有用的植物选自苹果、香蕉、柑橘、猕猴桃、甜瓜、桃、梨、菠萝、仁果、石榴、甘蓝、花椰菜、黄瓜、葫芦、番茄、马铃薯、小麦、稻和大豆。
附图说明
[0035]
图1描绘了在54℃下贮存2周之前和之后,无任何稳定剂或与脲、盐酸胍、三乙醇胺或甘油草酸乙酯(glycerol ethyl oxylate)混合的类芽孢杆菌属种菌株nrnr b-50972肉汤浓缩物(bc)的液体制剂中的相对杀镰孢菌素水平。
[0036]
图2描绘了在40℃下贮存2、4和8周之前和之后,无任何稳定剂或与脲、盐酸胍、三乙醇胺或甘油草酸乙酯混合的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的液体制剂中的相对杀镰孢菌素水平。
[0037]
图3描绘了在54℃下贮存2周之前和之后,无任何稳定剂或与脲、甜菜碱盐酸盐或磷酸氢二钾混合的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的液体制剂中的相对杀镰孢菌素水平。误差线表示所示数值的95%置信区间。
[0038]
图4描绘了在40℃下贮存8周之前和之后,无任何稳定剂或与脲、甜菜碱盐酸盐或磷酸氢二钾混合的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的液体制剂中的相对杀镰孢菌素水平。误差线表示所示数值的95%置信区间。
[0039]
图5描绘了在54℃下贮存2周之前和之后,用水或丙二醇以50∶50稀释的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的液体制剂中的相对杀镰孢菌素水平。
[0040]
图6描绘了在40℃下贮存2、4或8周之前和之后,用水或丙二醇以50∶50稀释的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的液体制剂中的相对杀镰孢菌素水平。
[0041]
图7描绘了在54℃下贮存2周后,不含脲的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc样品(“bc-脲”)和含脲的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc样品(“bc+脲”)的照片。
[0042]
图8描绘了在23℃下贮存2、4、8、26、52和104周之前和之后,无任何稳定剂或与脲混合的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的液体制剂中的相对杀镰孢菌素水平。
[0043]
图9描绘了在40℃下贮存4和8周之前和之后,无任何稳定剂或与脲混合的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc以及类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304 bc和类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306 bc各自与脲混合的液体制剂中的相对杀镰孢菌素水平。
[0044]
图10描绘了在23℃下贮存2、4、8、26和52周之前和之后,无任何稳定剂或与脲混合的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc以及类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304 bc和类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306 bc各自与脲混合的液体制剂中相对杀镰孢菌素水平。
[0045]
图11描绘了在40℃下贮存8周期间,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304、nrrl b-67306和nrrl b-67615的液体制剂中的相对杀镰孢菌素水平。液体制剂是不含脲的全肉汤(“wb-脲”)和含脲的肉汤浓缩物(“bc+脲”)。
[0046]
图12描绘了在4℃或23℃下贮存52周期间,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304、nrrl b-67306和nrrl b-67615的液体制剂中的相对杀镰孢菌素水平。液体制剂是不含脲的全肉汤(“wb-脲”)和含脲的肉汤浓缩物(“bc+脲”)。
具体实施方式
[0047]
已经发现特定的稳定剂保持了类芽孢杆菌属种菌株的抗真菌活性,使得其可以在升高的温度下和/或在延长的时间段内贮存和运输。类芽孢杆菌属种菌株包括类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67129、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67615以及由其衍生的杀真菌突变体。
[0048]
先前已将类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972和类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67129鉴定为具有广谱抗真菌活性的一组独特的杀镰孢菌素和杀镰孢菌素样化合物的生产者(wo 2016/154297)。如美国专利申请号62/671,067中所记载的,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972与类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304和类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306有关。杀镰孢菌素样化合物包括wo 2016/154297中所记载的paeniserine和paeniprolixin。另外的杀镰孢菌素样化合物包括wo 2016/020371中所记载的杀镰孢菌素类化合物(例如化合物1a、1b、2a、2b、4a、4b、5a和5b)。
[0049]
如本文所用,在本说明书和权利要求书中使用的动词“包含(comprise)”及其动词变形以其非限制性意义使用,以意指包括该词之后的项目,但是不排除未具体提及的项目。另外,以不定冠词提及元素“一(a)”或“一个(an)”不排除存在一个以上元素的可能性,除非上下文明确要求存在一个且仅存在一个元素。因此,不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。
[0050]
在某些实施方案中,本发明涉及稳定的杀真菌组合物,其包含:a)杀镰孢菌素和/或杀镰孢菌素样化合物;以及b)稳定剂,其选自胺、季铵化合物、磷酸盐或柠檬酸盐、具有2至10个碳原子的短链多元醇、脲及其组合。
[0051]
在其他实施方案中,本发明涉及稳定的杀真菌组合物,其包含:a)杀镰孢菌素和/或杀镰孢菌素样化合物;以及b)稳定剂,其选自胺、季铵化合物、磷酸盐或柠檬酸盐、具有2至10个碳原子的短链多元醇、脲、链烷醇胺、酰胺以及其组合。
[0052]
在一些实施方案中,本发明涉及稳定的杀真菌组合物,其包括:a)杀镰孢菌素和/或杀镰孢菌素样化合物;以及b)稳定剂,其选自碳酰二胺(co(nh2)2)、盐酸胍、三乙醇胺、甜菜碱盐酸盐、磷酸钾(二元的)、柠檬酸钾(三元的)及其组合。
[0053]
在某些实施方案中,稳定的组合物包含类芽孢杆菌属种菌株发酵液的无细胞制剂。在一方面,无细胞制剂包含杀镰孢菌素和/或杀镰孢菌素样化合物。
[0054]
应理解的是,本文中列举的所有数值范围意在包括其中包含的所有子范围。例如,1至10的范围意在包括在所列最小值1和所列最大值10之间(包括所列最小值1和所列最大值10)的所有子范围,即具有等于或大于1的最小值和等于或小于10的最大值。
[0055]
除非另有定义,否则本文所用的术语“烷基”是指从烷烃中去除氢原子衍生的直链、支链或环状饱和基团。代表性的直链烷基基团包括-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基和正庚基。代表性的支链烷基基团包括-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、-新戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基和1,2-二甲基丙基。代表性的环状烷基基团包括环己基、环戊基和环丙基。
[0056]
在一个实施方案中,该稳定剂是“脲”。如本文所用,术语“脲”是指具有由连接至两个胺残基的羰基基团组成的官能团的化合物,其中每个胺残基独立地为伯胺、仲胺或叔胺。最简单的脲是碳酰二胺(co(nh2)2),其中两个胺残基均为伯胺。
[0057]
在某些方面,脲是式(i)的取代脲
[0058][0059]
其中r1,r2和r3独立地为-h、-oh、c
1-c6烷基或-r5oh;r4为-r5oh;以及r5为c
1-c6烷基。
[0060]
取代脲的说明性种类是羟甲基脲、羟乙基脲、羟丙基脲;双(羟甲基)脲;双(羟乙基)脲;双(羟丙基)脲;n,n
′-
二羟甲基脲;n,n
′-
二羟乙基脲;n,n
′-
二羟丙基脲;n,n,n
′-
三羟乙基脲;四(羟甲基)脲;四(羟乙基)脲;四(羟丙基)脲;n-甲基-n
′-
羟乙基脲;n-乙基-n
′-
羟乙基脲;n-羟丙基-n
′-
羟乙基脲和n,n
′-
二甲基-n-羟乙基脲。在出现术语羟丙基的情况下,该含义对于3-羟基-正丙基、2-羟基-正丙基、3-羟基-异丙基或2-羟基-异丙基基团是通用的。
[0061]
在一些实施方案中,稳定剂是碳酰二胺(co(nh2)2)或取代脲。在其他实施方案中,稳定剂是碳酰二胺(co(nh2)2)。
[0062]
在某些方面,所公开的杀真菌组合物或制剂中的稳定剂包括脲和磷酸盐或柠檬酸盐。在一方面,磷酸盐或柠檬酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、柠檬酸二氢钾、柠檬酸氢二钾及其组合。
[0063]
如本文所用,术语“组合浓度”是指组合物或制剂中提及的单个组分的浓度之和。在一些实施方案中,脲和磷酸盐或柠檬酸盐以约2%至约3%的组合浓度存在于杀真菌组合物或制剂中。在其他实施方案中,脲和磷酸盐或柠檬酸盐以约0.1%至约3%、约0.5%至约
3%、约1%至约3%或约1.5%至约3%的组合浓度存在于杀真菌组合物或制剂中。在又其他实施方案中,脲和磷酸盐或柠檬酸盐以约0.1%至约2%、约0.25%至约2%、约0.5%至约2%或约1%至约2%的组合浓度存在于杀真菌组合物或制剂中。脲和磷酸盐或柠檬酸盐的此类混合物的非限制性实例在表1中给出。
[0064]
某些优点产生于组合物或制剂中脲和磷酸盐或柠檬酸盐的组合。多种稳定剂提高了杀镰孢菌素和杀镰孢菌素样化合物的稳定性,并且在一种稳定剂在不利条件下失效的情况下,另一种稳定剂可仍具有活性并发挥保护作用。另外,多元酸的盐(即磷酸盐和柠檬酸盐)对组合物或制剂提供ph缓冲作用,从而进一步稳定了体系。
[0065][0066]
在一些方面,稳定剂是链烷醇胺。如本文所用,“链烷醇胺”是在烷烃骨架上同时包
含羟基(-oh)和氨基(即伯、仲或叔氨基)官能团的化合物。
[0067]
在一方面,链烷醇胺是氨基醇。在另一方面,氨基醇是乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、异丙醇胺、二异丙醇胺(dipa)、三异丙醇胺(tipa)、甲醇胺、氨基甲基丙醇、庚胺醇、二甲基乙醇胺或n-甲基乙醇胺。在另又一方面,氨基醇是乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、异丙醇胺、二异丙醇胺(dipa)、三异丙醇胺(tipa)或甲醇胺。在一些实施方案中,氨基醇是乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺。在某些实施方案中,氨基醇是三乙醇胺。
[0068]
在又其它实施方案中,稳定剂是酰胺。在一些实施方案中,酰胺是有机酰胺、磺酰胺或磷酰胺。
[0069]
在一方面,有机酰胺是羧酰胺。在一些实施方案中,羧酰胺是乙酰胺或苯甲酰胺。
[0070]
在一些实施方案中,所公开的杀真菌组合物或制剂还包含蛋白酶抑制剂。在某些方面,蛋白酶抑制剂是天冬氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、苏氨酸蛋白酶抑制剂或胰蛋白酶抑制剂。在一方面,胰蛋白酶抑制剂是kunitz大豆胰蛋白酶抑制剂,也称为kunitz sti蛋白酶抑制剂。在其他方面,蛋白酶抑制剂是自杀性抑制剂、过渡态抑制剂、蛋白质蛋白酶抑制剂或螯合剂。在一方面,蛋白质蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)。
[0071]
除非另有特别说明,否则本文所述的微生物和特定菌株均从自然界分离并在人工条件下生长,例如摇瓶培养或通过扩大制造过程(例如在生物反应器中)以例如使生物活性代谢物的产生最大化。在这样的条件下生长导致菌株“驯化(domestication)”。通常,这样的“驯化”菌株与其天然存在的对应菌株的区别在于,“驯化”菌株被培养为均质种群(homogenous population),其不经受自然环境中存在的选择压力,但是经受到人工选择压力。
[0072]
本发明的微生物或培养物或其分离株可以描述为呈“分离的”或“生物纯的”形式。这些术语旨在意指微生物已经与环境或一种或多种组分、细胞或其他成分分离,如果在自然界或其他条件下,则它们可能与微生物相结合。术语“分离的”或“生物纯的”不应被用来表示微生物被纯化的程度。然而,在一个实施方案中,微生物的分离株或培养物主要含有本发明的微生物。
[0073]
培养类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972产生具有稳定菌落形态的自发变异菌株,其在本文中称为类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67129。类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67129与类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972密切相关,除了与类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972表达的spo0a相比,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67129表达的spo0a具有单个氨基酸置换。
[0074]
在一个实施方案中,提供了类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67129、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306或类芽孢杆菌属种菌株nrrlb-67615的突变菌株。术语“突变体”是指衍生自类芽孢杆菌属种菌株的遗传变体。在一个实施方案中,突变体具有一种或多种或全部类芽孢杆菌属种菌株的鉴定(功能)特征。在特定情况下,突变体或其发酵产物至少与类芽孢杆菌属种亲本菌株一样防治(作为鉴定的功能特征)真菌和/或细菌。此类突变体可以是遗传变体,其基因组序列与类芽孢杆菌属种亲本菌株具有大于约85%、大于约90%、大于约95%、大于约98%或大于约99%的序列同一性。可以通过以下方式获得突变体:用化学药品或辐射处理类芽孢杆菌属种菌株的细胞,或通过从类芽该孢杆菌属种菌株细胞群体中选择自发突变体
(例如噬菌体抗性或抗生素抗性突变体),通过基因组重排(genome shuffling)(如下所述)或通过本领域技术人员熟知的其他方式。
[0075]
可以通过使用称为原生质体融合的方法来促进类芽孢杆菌属种菌株之间的基因组重排。该方法开始于从营养细菌细胞形成原生质体。通常使用溶菌酶和渗透稳定剂去除肽聚糖细胞壁,这会导致原生质体的形成。光学显微镜下可以看到该过程伴随有球形细胞外观的出现。然后peg和聚乙二醇的加入诱导原生质体之间的融合,使两个或多个细胞的遗传成分接触,从而促进重组和基因组重排。随后融合的细胞重新分配,并在固体生长培养基上恢复。在恢复过程中,原生质体会重建肽聚糖细胞壁,并转变回细菌形状。参见schaeffer,et.al.,(1976)pnas usa,vol.73,6:2151-2155)。
[0076]
类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67129、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67615菌株及其突变体对多种植物病原体具有活性。在一方面,该菌株具有抗真菌活性、抗卵菌和/或抗细菌活性,真菌例如黄瓜炭疽病、黄瓜白粉病、小麦叶锈病、大麦白粉病、链格孢属(alternaria)和葡萄孢属(botrytis);卵菌例如番茄晚疫病、黄瓜霜霉病和芸苔霜霉病;细菌例如假单胞菌属(pseudomonas)、黄单胞菌属(xanthomonas)和欧文氏菌属(erwinia)。
[0077]
本发明还包括通过将包含产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株和稳定剂(选自脲、盐酸胍、三乙醇胺、甜菜碱盐酸盐、磷酸钾(二元的)、柠檬酸钾(三元的)及其组合)的水性制剂或杀真菌组合物施用于植物或植物部分(例如叶、茎、花、果实、根或种子)或通过施用于该植物或植物部分生长的位置(例如土壤)来处理植物以防治植物病害的方法。
[0078]
在根据本发明的方法中,组合物和制剂可被施用于生长在任何类型的用于生长植物的介质(例如土壤、蛭石、碎纸板和水)中的任何植物或任何植物的任何部分或施用于气生生长的植物或植物部分(例如兰花或鹿角蕨)。该组合物或制剂可以例如通过喷洒(spraying)、雾化(atomizing)、蒸发(vaporizing)、散播(scattering)、粉化(dusting)、添水(watering)、喷射(squirting)、喷洒(sprinkling)、倾注(pouring)或熏蒸(fumigating)来施用。如上文已经说明的,可以在目的植物所处的任何需要的场所进行施用,例如农业环境、园艺、森林、种植园、果园、苗圃、有机种植农作物、草皮和城市环境。
[0079]
根据本领域公知的方法(包括通过使用培养基和以下实施例中描述的其他方法),可以通过培养产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株来获得本发明的组合物。常规的大规模微生物培养方法包括深层发酵、固态发酵或液体表面培养。接近发酵结束时,随着营养物的消耗,细胞开始从生长期转变到孢子形成期,因此最终发酵产物主要是孢子、代谢产物和残留的发酵培养基。孢子形成是类芽孢杆菌属的天然生命周期的一部分,且通常由细胞对营养物限制的响应而开始。设置发酵以获得高水平的菌落形成单位并促进孢子形成。发酵产生的培养基中的细菌细胞、孢子和代谢产物可以直接使用或通过常规工业方法(例如离心、正切流动过滤、深层过滤和蒸发)浓缩。
[0080]
本发明的组合物包含发酵产物。在一些实施方案中,清洗浓缩发酵液(例如通过渗滤方法)以除去残留的发酵液和代谢物。如本文所用,术语“肉汤浓缩物”是指已如上所述由常规工业方法浓缩,但是以液体形式保留的全肉汤(发酵液)。如本文所用,术语“发酵固体”是指在发酵液干燥后保留的固体材料。如本文所用,术语“发酵产物”是指全肉汤、肉汤浓缩
物和/或发酵固体。本发明的组合物包含发酵产物。
[0081]
本发明菌株的发酵液的无细胞制剂可以通过本领域已知的任何方法(例如发酵液的提取、离心和/或过滤)获得。本领域技术人员将了解,取决于去除细胞所使用的技术(例如,离心速度),所谓的无细胞制剂可能无法不含细胞,而是在很大程度上没有细胞或基本上无细胞。所得的无细胞制剂可用有助于其施用于植物或植物生长培养基的组分来配制。上述的发酵液的浓缩方法和干燥技术也适用于无细胞制剂。
[0082]
在一个实施方案中,发酵产物包含至少约1
×
104菌落形成单位(cfu)微生物(例如,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972或其杀真菌突变菌株)/ml发酵液。在另一个实施方案中,发酵产物包含至少约1
×
105菌落形成单位(cfu)微生物(例如,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972菌株或其杀真菌突变菌株)/ml发酵液。在另一个实施方案中,发酵产物包含至少约1
×
106cfu微生物(例如,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972或其杀真菌突变菌株)/ml发酵液。在又一个实施方案中,发酵产物包含至少约1
×
107cfu微生物(例如,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972或其杀真菌突变菌株)/ml发酵液。在另一个实施方案中,发酵产物包含至少约1
×
108cfu微生物(例如,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972或其杀真菌突变菌株)/ml发酵液。在另一个实施方案中,发酵产物包含至少约1
×
109个微生物(例如,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972或其杀真菌突变菌株)的cfu/ml发酵液。在另一个实施方案中,发酵产物包含至少约1
×
10
10
cfu微生物(例如,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972或其杀真菌突变菌株)/ml发酵液。在另一个实施方案中,发酵产物包含至少约1
×
10
11
cfu微生物(例如,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972或其杀真菌突变菌株)/ml发酵液。
[0083]
本发明的组合物可以本身的形式来使用,或根据他们特定的物理和/或化学性质,以其制剂形式或从其制备的使用形式来使用,例如气雾剂、胶囊悬剂、冷雾化浓缩物、热雾化浓缩物、胶囊颗粒剂、微粒剂(fine granules)、用于种子处理的流动浓缩物、即用型溶液剂、粉剂、乳化浓缩物、水包油乳剂、油包水乳剂、大颗粒剂、微颗粒剂、油分散粉剂、油混溶性流动浓缩物、油混溶性液剂、气体(在压力下)、产气产品、发泡剂、糊剂、农药包被的种子、悬浮浓缩物、油分散液、悬乳剂浓缩物、可溶性浓缩物、悬浮剂、可湿性粉剂、可溶性粉剂、粉剂和颗粒剂(dusts and granules)、水溶性和水分散颗粒剂或片剂、用于种子处理的水溶性和水分散粉剂(powder)、浸透活性成分的天然产物和合成物质,以及用于种子的聚合物质中和包被材料中的微囊剂,以及ulv冷雾化和热雾化制剂。
[0084]
在一些实施方案中,本发明的组合物是液体制剂。液体制剂的非限制性实例包括悬浮浓缩物和油分散液。
[0085]
本发明的组合物可以包含惰性制剂,其被添加到包含细胞、无细胞制剂或代谢物的组合物中以改善功效、稳定性和可用性和/或促进加工、包装和终端使用应用。这样的惰性制剂和成分可以包括载体、稳定剂、营养物或物理性质改良剂,它们可以单独或组合添加。在一些实施方案中,载体可包括液体材料,例如水、油和其他有机或无机溶剂以及固体材料,例如矿物质、聚合物或通过生物方法或化学合成获得的聚合物复合物。在一些实施方案中,载体是促进组合物粘附至植物部分(例如种子或根)的粘合剂(binder)或胶粘剂(adhesive)。参见,例如,taylor,a.g.等人,“concepts and technologies of selected seed treatments”,annu.rev.phytopathol.28:321-339(1990)。稳定剂可包括抗结块剂、抗氧化剂、干燥剂、保护剂或防腐剂。营养物可以包括碳、氮和磷源,例如糖、多糖、油、蛋白
质、氨基酸、脂肪酸和磷酸盐。物理性质改良剂可包括填充剂、润湿剂、增稠剂、ph改良剂、流变改性剂、分散液、佐剂、表面活性剂、防冻剂或着色剂。在一些实施方案中,可以用水作为稀释剂或不使用水,而没有任何其他制剂的情况下,直接使用包含通过发酵产生的细胞、无细胞制剂或代谢产物的组合物。在一些实施方案中,在浓缩发酵液之后以及在干燥过程中和/或干燥之后添加惰性制剂。
[0086]
根据本发明可处理所有植物和植物部分。在本发明上下文中,植物可理解为意指全部植物和植物种群,如需要的和不需要的野生植物或作物植物(包括天然存在的作物植物)。作物植物可为通过常规育种和优化方法或通过生物技术和重组方法,或这些方法的组合而获得的植物,包括转基因植物且包括受到或不受植物育种者权利保护的植物品种。植物部分可理解为意指植物所有地上和地下部分以及器官,如幼苗(shoot)、叶、花和根,可提及的实例是叶、针叶、秆、茎、花、子实体、果实和种子、以及还有根、块茎和根茎。植物部分还包括作物材料以及营养繁殖和有性繁殖材料,例如插枝、块茎、根茎、接枝(slip)和种子。
[0087]
如上文已经提及的,可以根据本发明处理所有植物及其部分。在一个优选实施方案中,对野生生长的或通过传统生物育种方法(例如杂交或原生质体融合)获得的植物物种和植物品种及其部分进行处理。在另一个优选实施方案中,对通过重组方法(如果合适,与传统方法结合)获得的转基因植物和植物品种(遗传修饰的生物体),以及它们的部分进行处理。术语“部分”、“植物的部分”和“植物部分”已在上文解释。特别优选地根据本发明处理在每种情况下均是市售的或使用中的植物品种的植物。植物品种理解为意指通过传统育种、通过诱变或通过重组dna技术培育的具有新性状的植物。植物品种可以表现为品种、亚种(race)、生物型和基因型的形式。
[0088]
使用根据本发明的组合物进行的对植物和植物部分的处理可以直接进行,或通过使用常规处理方法作用于环境、生境或贮存空间,例如通过浸渍(dipping)、喷洒、雾化(atomizing)、成雾(misting)、蒸发(evaporating)、粉化、成雾(fogging)、散播(scattering)、起泡(foaming)、涂抹(painting on)、散播(spreading)、注射(injecting)、浸透(drenching)、滴灌溉(trickle irrigation),以及在繁殖材料的情况下,特别是在种子的情况下,还可以通过干种子处理方法、湿种子处理方法、浆液处理方法,通过形成外壳、通过用一种或多种包衣来包被等。此外,还可以通过超低容积法来施用活性物质,或将活性物质制剂或活性物质本身注射到土壤中。
[0089]
优选的植物直接处理是对叶施用处理,即将根据本发明的组合物施用于叶片,可使处理频率和施用率与所讨论的病原体的感染压力相匹配。
[0090]
在系统活性(systemically active)化合物的情况下,根据本发明的组合物经由根部系统到达植物。在这种情况下,通过使根据本发明的化合物作用于植物环境来进行植物处理。这可例如通过以下方式来进行:浸透、混合于土壤中或营养液中,即用液体形式的根据本发明的组合物来灌注在植物所处的位置(例如土壤或溶液培养体系),或通过土壤施用,即将根据本发明的组合物以固体形式(例如以颗粒形式)掺入到植物所处的位置。在水稻培养物的情况下,这也可以通过将根据本发明的组合物以固体使用形式(例如以颗粒形式)加到(meter)被淹没的水稻田来实现。
[0091]
优选的植物为那些有用植物、观赏植物、草坪,通常使用的在公共场合和家庭中被用作观赏植物的树木,以及林业树木。林业树木包含用于生产木材、纤维素、纸以及从树木
部分产生的产品的树木。
[0092]
本文上下文中使用的术语“有用植物”指这样的作物植物,即其被用作获得食品、饲料、燃料或用于工业目的的植物。
[0093]
可以用本发明的组合物和方法来处理和/或改善的有用的植物包括例如以下类型的植物:草皮、藤本植物、谷类,例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻、玉米和粟/高粱;甜菜,例如糖用甜菜和饲用甜菜;水果,例如仁果、核果和浆果,例如苹果、梨、李子、桃、扁桃、樱桃和浆果,例如草莓、树莓、黑莓;豆科植物,例如豆、小扁豆、豌豆和大豆;油类作物,例如油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可和花生;葫芦,例如南瓜(pumpkin/squash)、黄瓜和甜瓜;纤维植物,例如棉花、亚麻、大麻和黄麻;柑橘类水果,例如橙子、柠檬、葡萄柚和柑橘;蔬菜,例如菠菜、莴苣、芦笋、甘蓝物种、胡萝卜、洋葱、西红柿、马铃薯和甜椒;樟科(lauraceae),例如鳄梨、樟属(cinnamomum)、樟脑或其他植物,例如烟草、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶、辣椒、葡萄藤、啤酒花(hop)、香蕉、乳胶植物以及观赏植物,例如花、灌木、落叶树木和针叶树木。该列举是非限制性的。
[0094]
以下植物被认为是本发明的组合物和方法特别适用的靶作物:棉花、茄子、草坪、仁果、核果、浆果、玉米、小麦、大麦、黄瓜、烟草、藤本植物、稻、谷类、梨、豆、大豆、油菜、番茄、甜椒、甜瓜、甘蓝、马铃薯和苹果。
[0095]
本发明还可应用于任意草坪草,包括冷季型草坪草和暖季型草坪草。冷季型草坪草的实例为:早熟禾(早熟禾属种(poa spp.)),例如肯塔基早熟禾(草地早熟禾(poa pratensis l.))、粗茎早熟禾(普通早熟禾(poa trivialis l.))、加拿大早熟禾(加拿大早熟禾(poa compressa l.))、一年生早熟禾(早熟禾(poa annua l.))、高地早熟禾(高地早熟禾(poa glaucantha gaudin))、林地早熟禾(林地早熟禾(poa nemoralis l.))和鳞茎早熟禾(鳞茎早熟禾(poa bulbosa l.));翦股颖(翦股颖属种(agrostis spp.)),例如匍匐翦股颖(匍匐翦股颖(agrostis palustris huds.))、细弱翦股颖(细弱翦股颖(agrostis tenuis sibth.))、绒毛翦股颖(绒毛翦股颖(agrostis canina l.))、德国南部混合翦股颖(剪股颖属种,包括细弱翦股颖、绒毛翦股颖和匍匐翦股颖)和小糠草(小糠草(agrostis alba l.));
[0096]
羊茅(羊茅属种(festuca spp.)),例如紫羊茅(festuca rubra l.spp.rubra)、匍匐羊茅(匍匐羊茅(festuca rubra l.))、紫羊茅(紫羊茅(festuca rubra commutata gaud.))、羊茅(羊茅(festuca ovina l.))、硬羊茅(硬羊茅(festuca longifolia thuill.))、细叶羊茅(细叶羊茅(festucu capillata lam.))、高羊茅(高羊茅(festuca arundinacea schreb.))和牛尾草(牛尾草(festuca elanor l.));
[0097]
黑麦草(黑麦草属种(lolium spp.)),例如一年生黑麦草(多花黑麦草(lolium multiflorum lam.))、多年生黑麦草(多年生黑麦草(lolium perenne l.))和意大利黑麦草(多花黑麦草(lolium multiflorum lam.));
[0098]
以及冰草(冰草属种(agropyron spp.)),如扁穗冰草(扁穗冰草(agropyron cristatum(l.)gaertn.))、沙生冰草(沙生冰草(agropyron desertorum(fisch.)schult.))和蓝茎冰草(蓝茎冰草(agropyron smithii rydb.))。
[0099]
其他冷季型草坪草的实例为喜沙草(美洲沙茅草(ammophila breviligulata fern.))、无芒雀麦(无芒雀麦(bromus inermis leyss.))、香蒲(cattail),例如梯牧草(梯
牧草(phleum pratense l.))和沙香蒲(phleum subulatum l.)、鸭茅(鸭茅(dactylis glomerata l.))、碱茅(碱茅(puccinellia distans(l.)parl.))和洋狗尾草(洋狗尾草(cynosurus cristatus l.))。
[0100]
暖季型草坪草的实例为:狗牙根(狗牙根属种(cynodon spp.l.c.rich))、结缕草(结缕草属种(zoysia spp.willd.))、偏序钝叶草(偏序钝叶草(stenotaphrum secundatum walt kuntze))、假俭草(假俭草(eremochloa ophiuroides munro hack.))、地毯草(类地毯草(axonopus affinis chase))、百喜草(百喜草(paspalum notatum flugge))、狼尾草(狼尾草(pennisetum clandestinum hochst.ex chiov.))、野牛草(野牛草(buchloe dactyloids(nutt.)engelm.))、格兰马草(格兰马草(bouteloua gracilis(h.b.k.)lag.ex griffiths))、海滨雀稗(海滨雀稗(paspalum vaginatum swartz))和垂穗草(垂穗草(bouteloua curtipendula(michx.torr.))。冷季型草坪草通常优选地用于根据本发明的用途。尤其优选的是早熟禾、翦股颖和小糠草、羊茅和黑麦草。尤其优选的是翦股颖。
[0101]
本发明的组合物具有有效的杀微生物活性,并可用于在作物保护和材料保护中防治不想要的微生物,如真菌和细菌。
[0102]
本发明还涉及一种用于防治不想要的微生物的方法,其特征在于,将本发明的组合物施用于植物致病真菌、植物致病细菌和/或其生境。
[0103]
杀真菌剂可用于在作物保护中防治植物致病真菌。杀真菌剂的特征在于具有对抗广谱植物病原真菌的显著功效,所述植物病原真菌包括土壤传播的病原体,特别是根肿菌纲(plasmodiophoromycetes)、卵菌纲(peronosporomycetes(同义词:卵菌纲(oomycetes))、壶菌纲(chytridiomycetes)、接合菌纲(zygomycetes)、子囊菌纲(ascomycetes)、担子菌纲(basidiomycetes)和半知菌纲(deuteromycetes(同义词:半知菌纲(fungi imperfecti))的成员。一些杀真菌剂具有系统活性且可以作为叶片、拌种或土壤杀真菌剂用于植物保护中。此外,它们适合于防治真菌,尤其是侵扰植物的木材或根部的真菌。
[0104]
杀菌剂可用于作物保护中防治假单胞菌科(pseudomonadaceae)、根瘤菌科(rhizobiaceae)、肠杆菌科(enterobacteriaceae)、棒状杆菌科(corynebacteriaceae)和链霉菌科(streptomycetaceae)。
[0105]
可根据本发明处理的真菌性病害的病原体的非限制性实例包括:
[0106]
由白粉病病原体引起的病害,所述白粉病病原体例如,布氏白粉菌属(blumeria)种,例如禾本科布氏白粉菌(blumeria graminis);叉丝单囊壳属(podosphaera)种,例如苹果白粉菌(podosphaera leucotricha);单丝壳属(sphaerotheca)种,例如黄瓜白粉菌(sphaerotheca fuliginea);钩丝壳属(uncinula)种,例如葡萄白粉菌(uncinula necator);
[0107]
由锈病病原体引起的病害,所述锈病病原体例如,裸孢子囊菌属(gymnosporangium)种,例如梨锈菌(gymnosporangium sabinae);驼孢锈菌属(hemileia)种,例如咖啡锈菌(hemileia vastatrix);层锈菌属(phakopsora)种,例如豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)和山马蝗层锈菌(phakopsora meibomiae);柄锈菌属(puccinia)种,例如小麦隐匿柄锈菌(puccinia recondite)、小麦叶锈菌(p.triticina)、禾柄锈菌(p.graminis)或小麦条锈菌(p.striiformis);单孢锈菌属(uromyces)种,例如疣
顶单孢锈菌(uromyces appendiculatus);
[0108]
由卵菌纲病原体引起的病害,所述卵菌纲病原体例如,白锈菌属(albugo)种,例如白锈菌(albugo candida);盘梗霉属(bremia)种,例如莴苣盘梗霉菌(bremialactucae);斜尖状孢子菌属(peronospora)种,例如豌豆霜霉(peronospora pisi)或芸苔霜霉(p.brassicae);疫霉属(phytophthora)种,例如马铃薯晚疫病菌(phytophthora infestans);单轴霉属(plasmopara)种,例如葡萄单轴霉(plasmopara viticola);假霜霉属(pseudoperonospora)种,例如葎草假霜霉(pseudoperonospora humuli)或黄瓜霜霉病菌(pseudoperonospora cubensis);腐霉属(pythium)种,例如终极腐霉菌(pythium ultimum);
[0109]
由例如以下病原体引起的叶斑病和叶萎蔫病:链格孢属(alternaria)种,例如索兰尼链格孢(alternaria solani);尾孢菌属(cercospora)种,例如甜菜尾孢菌(cercospora beticola);枝孢属(cladiosporium)种,例如黄瓜叶霉病菌(cladiosporium cucumerinum);旋孢腔菌属(cochliobolus)种,例如禾旋孢腔菌(cochliobolus sativus)(分生孢子形式:德氏霉属(drechslera),同义词:长蠕孢霉(helminthosporium))、水稻旋孢腔菌(cochliobolus miyabeanus);毛盘孢属(colletotrichum)种,例如豆刺盘孢菌(colletotrichum lindemuthanium);环黑星霉属(cycloconium)种,例如油橄榄孔雀斑菌(cycloconium oleaginum);间座壳菌属(diaporthe)种,例如柑橘褐色蒂腐病菌(diaporthe citri);痂囊腔菌属(elsinoe)种,例如柑桔痂囊腔菌(elsinoe fawcettii);盘长孢菌属(gloeosporium)种,例如桃树腐烂病菌(gloeosporium laeticolor);小丛壳属(glomerella)种,例如炭疽病菌(glomerella cingulate);球座菌属(guignardia)种,例如葡萄球座菌(guignardia bidwelli);小球腔菌属(leptosphaeria)种,例如十字花科小球腔菌(leptosphaeria maculans)、颖枯壳小球腔菌(leptosphaeria nodorum);间座壳属(magnaporthe)种,例如稻瘟病菌(magnaporthe grisea);盘二孢属(marssonia)种,例如苹果盘二胞(marssonia coronaria);微结节菌属(microdochium)种,例如雪霉叶枯菌(microdochium nivale);球腔菌属(mycosphaerella)种,例如禾生球腔菌(mycosphaerella graminicola)、花生球腔菌(m.arachidicola)和斐济球腔菌(m.fijiensis);球腔菌属(phaeosphaeria)种,例如小麦叶枯病菌(phaeosphaeria nodorum);核腔菌属(pyrenophora)种,例如圆核腔菌(pyrenophora teres)、偃麦草核腔菌(pyrenophora tritici repentis);柱隔孢属(ramularia)种,例如柱隔孢叶斑病菌(ramularia collo-cygni)、白斑柱隔孢(ramularia areola);喙孢属(rhynchosporium)种,例如大麦云纹病菌(rhynchosporium secalis);壳针孢菌属(septoria)种,例如芹菜壳针孢菌(septoria apii)、番茄壳针孢(septoria lycopersii);核瑚菌属(typhula)种,例如肉孢核瑚菌(typhula incarnate);黑星菌属(venturia)种,例如苹果黑星菌(venturia inaequalis);
[0110]
由例如以下病原体引起的根和茎的病害:伏革菌属(corticium)种,例如禾伏革菌(corticium graminearum);镰刀菌属(fusarium)种,例如尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum);禾顶囊壳属(gaeumannomyces)种,例如小麦全蚀病菌(gaeumannomyces graminis);丝核菌属(rhizoctonia)种,诸如,例如立枯丝核菌(rhizoctonia solani);例如由稻帚枝霉(sarocladium oryzae)引起的帚枝霉属(sarocladium)病害;例如由稻小球
核菌(sclerotium oryzae)引起的小核菌属(sclerotium)病害;tapesia属种,例如tapesia acuformis;根串珠霉属(thielaviopsis)种,例如烟草根黑腐病菌(thielaviopsis basicola);
[0111]
由例如以下病原体引起的肉穗花序和圆锥花序(ear and panicle)病害(包括玉米穗轴):链格孢属(alternaria)种,例如链格孢属种(alternaria ssp.);曲霉属(aspergillus)种,例如黄曲霉菌(aspergillus flavus);分枝孢属(cladosporium)种,例如支孢样枝孢霉(cladosporium cladosporioides);麦角菌属(claviceps)种,例如紫色麦角菌(claviceps purpurea);镰刀菌属(fusarium)种,例如大刀镰刀菌(fusarium culmorum);赤霉菌属(gibberella)种,例如玉米赤霉(gibberella zeae);小画线壳属(monographella)种,例如雪腐小画线壳(monographella nivalis);壳针孢属(septoria)种,例如小麦颖枯壳针孢菌(septoria nodorum);
[0112]
由例如以下黑粉菌引起的病害:轴黑粉菌属(sphacelotheca)种,例如玉米丝轴黑粉菌(sphacelotheca reiliana);腥黑粉菌属(tilletia)种,例如小麦腥黑穗病菌(tilletia caries)、小麦矮腥黑穗病菌(t.controversa);条黑粉菌属(urocystis)种,例如黑麦杆黑穗病菌(urocystis occulta);黑粉菌属(ustilago)种,例如裸黑粉菌(ustilago nuda)、散黑穗病菌(u.nuda tritici);
[0113]
由例如以下病原体引起的果实腐烂:曲霉属(aspergillus)种,例如黄曲霉菌(aspergillus flavus);葡萄孢属(botrytis)种,例如灰葡萄孢菌(botrytis cinerea);青霉属(penicillium)种,例如扩展青霉菌(penicillium expansum)和产紫青霉(p.purpurogenum);核盘霉属(sclerotinia)种,例如核盘菌(sclerotinia sclerotiorum);轮枝孢属(verticilium)种,例如黑白轮枝孢(verticilium alboatrum);
[0114]
由例如以下病原体引起的种传和土传的腐败、发霉、萎蔫、腐烂和猝倒病害:链格孢属(alternaria)种,例如由甘蓝链格孢菌(alternaria brassicicola)引起的;丝囊霉属(aphanomyces)种,例如由根腐丝囊霉(aphanomyces euteiches)引起的;壳二孢菌属(ascochyta)种,例如由晶状体壳二孢(ascochyta lentis)引起;曲霉属(aspergillus)种,例如由黄曲霉菌(aspergillus flavus)引起的;分枝孢子菌属(cladosporium)种,例如由分枝胞子菌(cladosporium herbarum)引起的;旋孢腔菌属(cochliobolus)种,例如由禾旋孢腔菌(cochliobolus sativus)引起的;(分生孢子形式:德氏霉属(drechslera)、双极霉属(bipolaris),同义词:长蠕孢属(helminthosporium));毛盘孢属(colletotrichum)种,例如由炭疽菌(colletotrichum coccodes)引起的;镰刀菌属(fusarium)种,例如由黄色镰刀菌(fusarium culmorum)引起的;赤霉菌属(gibberella)种,例如由玉米赤霉(gibberella zeae)引起的;壳球孢属(macrophomina)种,例如由菜豆壳球孢菌(macrophomina phaseolina)引起的;小画线壳属(monographella)种,例如由雪腐小画线壳(monographella nivalis)引起的;青霉属(penicillium)种,例如由扩展青霉菌(penicillium expansum)引起的;茎点霉属(phoma)种,例如由黑胫茎点霉(phoma lingam)引起的;拟茎点霉属(phomopsis)种,例如由大豆拟茎点霉(phomopsis sojae)引起的;疫霉属(phytophthora)种,例如由恶疫霉(phytophthora cactorum)引起的;核腔菌属(pyrenophora)种,例如由麦类核腔菌(pyrenophora graminea)引起的;梨孢属(pyricularia)种,例如由稻瘟病菌(pyricularia oryzae)引起的;腐霉菌属(pythium)种,
trifolii))、叶点霉属(phyllosticta)叶斑病(大豆生叶点霉(phyllosticta sojaecola))、英和茎枯萎病(大豆拟茎点霉(phomopsis sojae))、白粉病(扩散叉丝壳(microsphaera diffusa))、棘壳孢属(pyrenochaeta)叶斑病(大豆棘壳孢(pyrenochaeta glycines))、丝核菌属地上部分、叶枯病和立枯病(web blight)(立枯丝核菌(rhizoctonia solani))、锈病(豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)、山马蝗层锈菌(phakopsora meibomiae))、痂病(大豆痂圆孢(sphaceloma glycines))、匍柄霉属(stemphylium)叶枯病(匍柄霉(stemphylium botryosum))、靶斑病(山扁豆生棒孢菌(corynespora cassiicola))。
[0126]
由例如以下病原体引起的根部和茎基部的真菌病害:黑根腐病(丽赤壳菌(calonectria crotalariae));炭腐病(菜豆生壳球孢菌(macrophomina phaseolina));镰孢属枯萎病或萎蔫病、根腐病以及荚和根颈腐烂(尖镰孢(fusarium oxysporum)、直喙镰孢(fusarium orthoceras)、半裸镰孢(fusarium semitectum)、木贼镰孢(fusarium equiseti));mycoleptodiscus根腐病(mycoleptodiscus terrestris);新赤壳属(neocosmospora)(侵管新赤壳(neocosmospora vasinfecta));荚和茎枯病(菜豆间座壳(diaporthe phaseolorum));茎溃疡(大豆北方茎溃疡病菌(diaporthe phaseolorum var.caulivora));疫霉属腐病(大雄疫霉(phytophthora megasperma));褐茎腐病(大豆茎褐腐病菌(phialophora gregata));腐霉属腐病(瓜果腐霉(pythium aphanidermatum)、畸雌腐霉(pythium irregular)、德巴利腐霉(pythium debaryanum)、群结腐霉(pythium myriotylum)、终极腐霉(pythium ultimum));丝核菌根腐病、茎腐病和猝倒病(立枯丝核菌(rhizoctonia solani));核盘菌茎腐病(核盘菌(sclerotinia sclerotiorum));核盘菌白绢病(棉花白绢病(sclerotinia rolfsii));根串珠霉属根腐病(根串珠霉(thielaviopsis basicola))。
[0127]
本发明的杀真菌组合物可用于治疗性或保护性/预防性地防治植物致病真菌。因此,本发明也涉及通过使用本发明的组合物来防治植物致病真菌的治疗性和保护性方法,其中将所述组合物施用于种子、植物或植物部分、果实或植物所生长的土壤。
[0128]
所述组合物在防治植物病害所需的浓度下可被植物良好地耐受,这一事实使得其能够处理植物的地上部分、繁殖的根状茎和种子以及土壤。
[0129]
根据本发明可以处理所有植物和植物部分,包括栽培种和植物品种(无论是否受植物品种或植物育种者权利的保护)。栽培种和植物品种可为通过常规的繁殖和育种方法而获得的植物,所述常规的繁殖和育种方法可通过一种或多种以下的生物技术方法来辅助或补充,例如:通过使用双单倍体、原生质体融合、随机和定向诱变、分子或遗传标记物,或通过生物工程和基因工程方法。
[0130]
在某些方面,本发明的组合物以每公顷约1
×
108至约1
×
10
14
菌落形成单位(cfu)的杀真菌类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972或其杀真菌突变菌株来施用。在其他方面,本发明的组合物以每公顷约1
×
109至约1
×
10
13
菌落形成单位(cfu)的杀真菌类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972或其杀真菌突变菌株来施用。在又其他方面,本发明的组合物以每公顷约1
×
10
10
至约1
×
10
12
菌落形成单位(cfu)的杀真菌类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972或其杀真菌突变菌株来施用。
[0131]
在一些实施方案中,本发明的组合物以每公顷约0.1kg至约10kg发酵固体来施用。
在其他实施方案中,本发明的组合物以每公顷约0.25kg至约7.5kg发酵固体来施用。在又其他实施方案中,本发明的组合物以每公顷约0.5kg至约5kg发酵固体来施用。本发明的组合物也可以每公顷约1kg至约2kg发酵固体来施用。
[0132]
当被植物良好地耐受时,本发明的组合物具有有利的恒温动物毒性,且可被环境良好地耐受,适用于保护植物和植物器官,用以提高收获产量,用于改善所收获材料的品质。优选地将它们用作作物保护组合物。它们对一般敏感且具有抗性的物种具有活性,并且对所有的或一些发育阶段具有活性。
[0133]
可以根据本发明进行处理的植物包括下列主要作物植物:玉米、大豆、苜蓿、棉花、向日葵、芸苔属(brassica)油料种子(如欧洲油菜(brassica napus)(例如,加拿大油菜(canola)、油菜籽)、芜菁(brassica rapa)、芥菜(b.juncea)(例如,(田野)芥菜)和埃塞俄比亚芥菜(brassica carinata)、槟榔科种(arecaceae sp.)(例如,油棕、椰子)、稻、小麦、甜菜、甘蔗、燕麦、黑麦、大麦、粟和高粱、黑小麦、亚麻、坚果、葡萄和藤本植物及来自各种植物分类单位的各种水果和蔬菜,例如,蔷薇科种(rosaceae sp.)(例如,仁果类水果(例如苹果和梨),还有核果类水果(例如杏子、樱桃、扁桃、李子和桃子),以及浆果类水果(例如草莓、覆盆子、红醋栗和黑醋栗以及圆醋粟))、茶薦子科种(ribesioidae sp.)、胡桃科种(juglandaceae sp.)、桦木科种(betulaceae sp.)、漆树科种(anacardiaceae sp.)、壳斗科种(fagaceae sp.)、桑科种(moraceae sp.)、木犀科种(oleaceae sp.)(例如橄榄树)、猕猴桃科种(actinidaceae sp.)、樟科种(lauraceae sp.)(例如,鳄梨、肉桂、樟脑)、芭蕉科种(musaceae sp.)(例如,香蕉树和香蕉种植园)、茜草科种(rubiaceae sp.)(例如,咖啡)、山茶科种(theaceae sp.)(例如,茶)、梧桐科种(sterculiceae sp.)、芸香科种(rutaceae sp.)(例如,柠檬、橙、桔和葡萄柚);茄科种(solanaceae sp.)(例如,番茄、马铃薯、胡椒、辣椒、茄子、烟草)、百合科种(liliaceae sp.)、菊科种(compositae sp.)(例如,莴苣、朝鲜蓟和菊苣(chicory)——包括根菊苣、菊苣(endive)或普通菊苣)、伞形科种(umbelliferae sp.)(例如,胡萝卜、欧芹、西芹和块根芹)、葫芦科种(cucurbitaceae sp.)(例如,黄瓜——包括小黄瓜、南瓜、西瓜、葫芦和甜瓜)、葱科种(alliaceae sp.)(例如,韭和洋葱)、十字花科种(cruciferae sp.)(例如,白甘蓝、红甘蓝、青花菜、花椰菜、抱子甘蓝、小白菜、苤蓝、小萝卜、山葵、水芹和大白菜)、豆科种(leguminosae sp.)(例如,花生、豌豆、扁豆和菜豆——例如,刀豆和蚕豆)、藜科种(chenopodiaceae sp.)(例如唐莴苣、饲用甜菜、菠菜、甜菜根)、亚麻科种(linaceae sp.)(例如,大麻)、大麻科种(cannabeacea sp.)(例如,印度大麻)、锦葵科种(malvaceae sp.)(例如,秋葵、可可)、罂粟科(papaveraceae)(例如,罂粟)、天门冬科(asparagaceae)(例如,芦笋);园艺和森林中的有用植物和观赏植物,包括草坪、草地、牧草和甜菊(stevia rebaudiana);以及在每种情况下这些植物的基因修饰型。
[0134]
在某些方面,发酵产物还包含制剂成分。所述制剂成分可以是润湿剂、增量剂、溶剂、自发性促进剂、乳化剂、分散剂、防冻剂、增稠剂和/或佐剂。在一个实施方案中,所述制剂成分是润湿剂。在其他方面,发酵产物是冻干粉末或喷雾干燥的粉末。
[0135]
本发明的组合物可以包括制剂成分,其被添加到本发明的组合物中以改善回收、功效或物理性质和/或帮助加工、包装和施用。这样的制剂成分可以单独或组合添加。
[0136]
可以将制剂成分添加到包含细胞、无细胞制剂、分离的化合物和/或代谢物的组合物中,以改善功效、稳定性和物理性质、可用性和/或促进加工、包装和终端使用应用。这样
的制剂成分可以包括农业上可接受的载体、惰性物质、稳定剂、防腐剂、营养物或物理性质改良剂,它们可以单独或组合添加。在一些实施方案中,载体可包括液体材料,例如水、油和其他有机或无机溶剂以及固体材料,例如矿物质、聚合物或通过生物方法或化学合成获得的聚合物复合物。在一些实施方案中,制剂成分是促进组合物粘附至植物部分(例如叶、种子或根)的粘合剂、佐剂或胶粘剂。参见,例如,taylor,a.g.等人,“concepts and technologies of selected seed treatments,”annu.rev.phytopathol.,28:321-339(1990)。稳定剂可包括抗结块剂、抗氧化剂、抗沉降剂、消泡剂、干燥剂、保护剂或防腐剂。营养物可以包括碳、氮和磷源,例如糖、多糖、油、蛋白质、氨基酸、脂肪酸和磷酸盐。物理性质改良剂可包括填充剂、润湿剂、增稠剂、ph改良剂、流变改性剂、分散液、佐剂、表面活性剂、成膜剂、助水溶剂、增洁剂、防冻剂或着色剂。在一些实施方案中,可使用水作为稀释剂或不使用水,而没有任何其他制剂的情况下,直接使用包含通过发酵产生的细胞、无细胞制剂和/或代谢产物的组合物。在一个具体的实施方案中,将润湿剂或分散剂添加至发酵固体,例如冻干或喷雾干燥的粉末。当被施用到表面时,润湿剂提高活性成分的扩散和渗透性质,或分散剂可提高活性成分的分散性和溶解性(一旦稀释)。示例性的润湿剂是本领域技术人员已知的,且包括磺基琥珀酸酯及其衍生物,例如multiwet
tm mo-70r(croda inc.,edison,nj);硅氧烷,例如(evonik,germany);非离子型化合物,例如atlox
tm 4894(croda inc.,edison,nj);烷基多聚葡萄糖苷,例如3001(huntsman international llc,the woodlands,texas);c
12-c
14
醇乙氧基化物,例如15-s-15(the dow chemical company,midland,michigan);磷酸酯,例如bg-510(rhodia,inc.);以及烷基醚羧酸酯,例如emulsogen
tm ls(clariant corporation,north carolina)。
[0137]
本发明进一步提供了作为作物保护剂和/或杀虫剂的制剂及由其制备的施用形式(例如浸透、浸渍和喷雾液剂),其包含至少一种本发明的活性化合物。所述施用形式可以进包含其他作物保护剂和/或杀虫剂和/或增强活性的佐剂(例如渗透剂,实例是植物油(例如,菜籽油、葵花油)、矿物油(例如,液体石蜡)、植物脂肪酸的烷基酯(例如菜籽油甲基酯或大豆油甲基酯)或者链烷醇烷氧基化物)),和/或铺展剂(例如,烷基硅氧烷和/或盐,实例是有机或无机铵或磷盐,实例是硫酸铵或磷酸氢二铵),和/或保持促进剂(例如磺基琥珀酸二辛酯或羟丙基瓜尔胶聚合物),和/或保湿剂(例如甘油),和/或肥料(例如铵、钾或磷肥)。
[0138]
所讨论的制剂或施用形式优选包含助剂,例如增量剂(extender)、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防冻剂、杀生物剂(biocide)、增稠剂和/或其他助剂,例如佐剂。在本文中,佐剂是增强制剂的生物学作用的组分,而该组分本身不具有生物学作用。佐剂的实例是促进保持、铺展、粘附至叶表面或渗透的试剂。
[0139]
这些制剂是以已知的方式制备的,例如通过将活性化合物与助剂(例如增量剂、溶剂和/或固体载体)和/或其他助剂(例如表面活性剂)混合来制备。
[0140]
所用的助剂可以为适用于赋予活性化合物的制剂或由这些制剂制得的施用形式(例如有用的作物保护剂,例如喷雾液剂或拌种产品)特殊特性(例如某些物理、技术和/或生物学特性)的物质。
[0141]
合适的增量剂是,例如水、极性和非极性有机化学液体,例如来自芳香烃和非芳香烃类(例如石蜡、烷基苯、烷基萘、氯苯)、醇和多元醇(如果合适,其也可以被取代、醚化和/或酯化)、酮(例如丙酮、环己酮)、酯(包括脂肪和油)和(聚)醚、未被取代的和被取代的胺、酰胺、内酰胺(例如n-烷基吡咯烷酮)和内酯、砜和亚砜(例如二甲亚砜)。
[0142]
如果所用的增量剂为水,也可以采用例如有机溶剂作为助溶剂。合适的液体溶剂主要是:芳香族化合物,例如二甲苯、甲苯或烷基萘;氯代芳香族化合物和氯代脂肪族烃,例如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷;脂肪族烃,例如环己烷或石蜡,例如石油馏分、矿物油和植物油;醇(例如丁醇或乙二醇)以及其醚和酯;酮,例如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或环己酮;强极性溶剂,例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜,以及水。
[0143]
原则上,可以使用所有合适的溶剂。合适的溶剂是:例如,芳香族烃,例如二甲苯、甲苯或烷基萘;例如,氯代芳香族烃或脂肪族烃,例如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷;例如,脂肪族烃,例如环己烷,例如石蜡、石油馏分、矿物油和植物油;醇,例如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇或乙二醇及其醚和酯;酮,例如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或环己酮;例如强极性溶剂,例如二甲基亚砜以及水。
[0144]
原则上,可以使用所有合适的载体。合适的载体具体是:例如,铵盐和磨碎的天然矿物(例如高岭土、粘土、滑石、白垩、石英、绿坡缕石、蒙脱石或硅藻土),和磨碎的合成矿物质(例如细分散的二氧化硅、氧化铝)和天然或合成的硅酸盐、树脂、蜡和/或固体肥料。同样可以使用这样的载体的混合物。适用于颗粒剂的载体包括:例如,粉碎并分级的天然矿石(例如方解石、大理石、浮石、海泡石、白云石),以及无机和有机粉状物的合成颗粒,以及有机材料(例如锯末、纸、椰壳、玉米穗轴及烟草秸杆)的颗粒。
[0145]
还可以使用液化的气体增量剂或溶剂。特别合适的是在标准温度和在标准压力下为气态的那些增量剂或载体,例子是气溶胶推进剂,例如卤代烃,以及丁烷、丙烷、氮气和二氧化碳。
[0146]
具有离子或非离子特性的乳化剂和/或发泡剂、分散剂或润湿剂,或这些表面活性物质的混合物的实例是:聚丙烯酸的盐;木素磺酸的盐;苯酚磺酸或萘磺酸的盐;环氧乙烷与脂肪醇或与脂肪酸或与脂肪胺、与取代酚(优选烷基酚或芳基酚)的缩聚物;磺基丁二酸酯的盐;牛磺酸衍生物(优选牛磺酸烷基酯);聚乙氧基化醇或酚的磷酸酯;多元醇的脂肪酸酯;以及含有硫酸盐、磺酸盐和磷酸盐的化合物的衍生物,例如烷基芳基聚乙二醇醚、烷基磺酸盐、烷基硫酸盐、芳基磺酸盐、蛋白水解物、木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。如果活性化合物之一和/或惰性载体之一不溶于水并且当在水中进行施用时,则表面活性物质的存在是有利的。
[0147]
可以存在于制剂中及由其获得的施用形式中的其它助剂包括着色剂,例如无机颜料,如氧化铁、氧化钛、普鲁士蓝,和有机染料,例如茜素染料、偶氮染料和金属酞菁染料,以及营养物和微量营养物,如铁盐、锰盐、硼盐、铜盐、钴盐、钼盐和锌盐。
[0148]
可存在的另外的组分为稳定剂(例如低温稳定剂)、防腐剂、抗氧化剂、光稳定剂或者改进化学和/或物理稳定性的其他试剂。还可以存在发泡剂或消泡剂。
[0149]
此外,所述制剂及由其获得的施用形式还可以包含以下物质作为另外的助剂:粘着剂,诸如羧甲基纤维素;以及粉末、颗粒或胶乳形式的天然的和合成的聚合物,例如阿拉伯树胶、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯;以及天然磷脂(例如脑磷脂和卵磷脂)和合成磷脂。其它
助剂可包括矿物油和植物油。
[0150]
所述制剂及由其获得的施用形式中可以存在其他助剂。这样的添加剂的实例包括香料、保护性胶体、粘合剂、胶粘剂、增稠剂、触变性物质、渗透剂、保持促进剂、稳定剂、多价螯合剂、络合剂、保湿剂和铺展剂。一般而言,所述活性化合物可以与通常用于制剂目的的任何固体或液体添加剂相组合。
[0151]
合适的保持促进剂包括降低动态表面张力(例如磺基琥珀酸二辛酯)或增加粘弹性(例如羟丙基瓜尔胶聚合物)的所有那些物质。
[0152]
在本发明的上下文中合适的渗透剂包括通常用于增强活性农业化学化合物渗透至植物的所有那些物质。本文中如下定义渗透剂:从(通常水性的)施用液剂和/或从喷雾涂层,它们能够穿透植物的表皮并由此增加活性化合物在表皮中的流动性。使用文献中记载的方法(baur等人,1997,pesticide science 51,131-152),可以确定该特性。实例包括:醇烷氧基化物(例如椰子脂肪乙氧基化物(10)或异十三烷基乙氧基化物(12));脂肪酸酯(例如菜籽油甲酯或大豆油甲酯);脂肪胺烷氧基化物(例如牛脂胺乙氧基化物(15))或铵和/或磷盐(例如硫酸铵或磷酸氢二铵)。
[0153]
保藏信息
[0154]
本发明的类芽孢杆菌属种菌株的样品根据布达佩斯条约保藏在农业研究机构培养物保藏中心(agricultural research service culture collection),其位于美国伊利诺伊州皮奥里亚市北部大学街1815号,美国农业部农业研究局,农业应用研究国家中心(nrrl),邮编61604。类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972于2014年8月28日保藏。类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67129于2015年9月1日保藏。类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304和类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306均于2016年7月22日保藏。类芽孢杆菌属种nrrl b-67615于2018年5月3日保藏。
[0155]
类芽孢杆菌属种菌株被保存在这样的条件下,即确保在本专利申请的在审期间,由专利和商标专员根据37 c.f.r.
§
1-14和35 u.s.c.
§
122确定的有资格的人能够获得培养物。然而,应当理解,可获得保藏物并非许可在违背政府授予的专利权的情况下实施本发明。
[0156]
以下给出的实施例仅用于本发明的说明性和非限制性目的。
[0157]
实施例1.稳定的类芽孢杆菌属制剂的抗真菌活性
[0158]
类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972菌株在大豆基的培养基中生长,以产生全肉汤培养物。然后将全肉汤培养物离心并浓缩以产生肉汤浓缩物(bc)。为了评估各种化合物作为稳定剂的效果,取类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc样品并与脲、盐酸胍、三乙醇胺或甘油草酸乙酯以60∶40(bc∶水)的稀释度混合至终浓度为2%(即20mg/ml)。样品分为三组,并保存于以下贮存条件之一:1)环境温度(23℃)下2周;2)40℃下2周;或3)54℃下2周。在每组中包括无任何稳定剂的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的60∶40(bc∶水)稀释液,作为对照。
[0159]
在贮存2周结束时,将样品以表2所示的浓度施用于番茄植株。浓度(即施用率)是参照处理在水中的稀释度。进行各种处理后,将含有索兰尼链格孢接种物的溶液喷洒到植物上。暴露于植物病原体接种物后几天,相对于未处理的对照植物,以病原体防治百分比对每株植物进行评分。在每次测定中,未处理的对照植物的病害发生率在75%至100%之间。
处理进行了三或四次重复评估,并报告平均防治百分比和标准差(参见表2)。0%是指与未处理的对照组相当的效力,而100%的效力是指没有观察到病害。每次测定均包括用已知对索兰尼链格孢具有活性的aso(枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)qst713)的对照处理。另外,将仅含有在水中稀释的脲的空白施用于植物,未观察到其对索兰尼链格孢具有任何活性。
[0160]
与脲、盐酸胍或三乙醇胺混合的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的60∶40(bc∶水)稀释液样品置于以下贮存条件下:1)4℃下8周;2)环境温度(23℃)下8周;或3)40℃下8周。将样品在水中稀释并如上所述通过试验来评估其对番茄植物中索兰尼链格孢的活性。第二组测定结果在表3中示出。
[0161]
第三组测定是用与脲、盐酸胍、三乙醇胺或甘油草酸乙酯混合的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的60∶40(bc∶水)稀释液样品进行的,所述样品置于以下贮存条件下:1)4℃下6个月;或2)环境温度(23℃)下6个月。这些测定的结果示于表4。
[0162]
在这三种测定中,脲、盐酸胍和三乙醇胺各自保留了类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的抗真菌活性,而添加甘油草酸乙酯的几乎没有作用。正如预期的,在经受最苛刻的贮存条件的样品中,化合物的稳定作用最为明显(即表2所示的54℃下2周,表3中40℃下8周,以及表4中环境温度(23℃)下6个月)。
[0163]
[0164]
[0165]
[0166]
[0167]
[0168]
[0169][0170]
实施例2.定量稳定的类芽孢杆菌属制剂中的杀镰孢菌素a
[0171]
已知类芽孢杆菌属细胞会产生包括杀镰孢菌素a在内的几种抗真菌化合物。为了确定稳定剂对实施例1中分析的与脲、盐酸胍、三乙醇胺或甘油草酸乙酯混合的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc样品中杀镰孢菌素a水平的影响,用有机溶剂萃取样品以生产细胞提取物。
[0172]
使用高效液相色谱/质谱飞行时间(hplc/ms tof)通过色谱方法定量这些提取物中的杀镰孢菌素a的相对水平,如下:柱:ymc
tm
basic 4.6
×
250mm,5μm;水(0.1%fa)和乙腈(0.1%甲酸(fa));梯度(%b):0-9分钟28-30%;9-14分钟30-33%;14-34分钟33-50%;冲洗。
[0173]
每次hplc/ms-tof分析均运行包含类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972全肉汤培养物的-80℃下贮存的标准样品,并以该标准样品中的杀镰孢菌素a的峰面积作为基础,对剩
余样品中的峰面积进行归一化,并计算报告的相对量。
[0174]
在54℃下贮存2周或在40℃下贮存8周的具有和不具有稳定剂的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的样品中杀镰孢菌素a的相对量分别示于图1和图2。对于贮存于40℃的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc,于贮存0周、2周、4周和8周取样并进行分析。
[0175]
脲、盐酸胍和三乙醇胺抑制了类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc样品中杀镰孢菌素a的降解。相反,在这些样品中添加甘油草酸乙酯对杀镰孢菌素a的稳定性几乎没有影响。在环境温度(23℃)下贮存6个月的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc样品中的杀镰孢菌素a的相对定量证实了图1和2中观察到的趋势。
[0176]
这些结果与表2-4中给出的数据相符,其中在延长的时间段内和/或在升高的温度下贮存类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc后,脲、盐酸胍和三乙醇胺均保留了对索兰尼链格孢的抗真菌活性,而甘油草酸乙酯几乎没有作用。
[0177]
实施例3.评估其他稳定的类芽孢杆菌属制剂
[0178]
如实施例1中所述,制备了含有几种候选稳定剂之一的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的其他稳定制剂,并评估了其对索兰尼链格孢的抗真菌活性。将候选稳定剂加入到类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的70∶30(bc∶水)稀释液中至终浓度2%或0.5%。然后将稳定制剂贮存在54℃下2周或在40℃下8周,并与无任何稳定剂的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc相比。
[0179]
如实施例1中所述,进行实验测定不同稳定制剂的抗真菌活性。在表5-8中所示的施用率下测量抗索兰尼链格孢或灰葡萄孢菌的活性。浓度(即施用率)是参照处理在水中的稀释度。0%是指与未经处理的对照组相当的效力,而100%的效力是指没有观察到病害。
[0180]
甜菜碱盐酸盐与脲一起在稳定类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc对索兰尼链格孢和灰葡萄孢菌的抗真菌活性方面显示出强大的作用。磷酸钾(二元的)的稳定作用小于脲和甜菜碱盐酸盐的稳定作用。其他几种候选稳定剂对类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的抗真菌活性没有显著影响。
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188][0189]
实施例4.定量其他稳定的类芽孢杆菌制剂中的杀镰孢菌素a
[0190]
使用实施例2中所述的定量方法确定实施例3中制备的样品中存在的杀镰孢菌素a的相对量。在54℃下贮存2周或在40℃下贮存8周后,含有和不含稳定剂的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的这些其他样品中的杀镰孢菌素a的相对量分别在图3和图4中示出。
[0191]
脲和甜菜碱盐酸盐保留了类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc样品中的杀镰孢菌素a,而磷酸钾(二元的)对稳定这些样品中的杀镰孢菌素a的作用较小。还分析了与未保留抗真菌活性的候选稳定剂混合的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc样品。这些样品中杀镰孢菌素a的降解与不含任何稳定剂的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc相似。
[0192]
这些结果与表5-8中给出的数据一致,其中加入脲和甜菜碱盐酸盐可保持类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc在54℃下贮存2周或在40℃下贮存8周后对索兰尼链格孢和灰葡萄孢菌的抗真菌活性,而磷酸钾(二元的)的稳定作用较小。
[0193]
实施例5.评估具有磷酸钾(一元的)、磷酸钾(二元的)或柠檬酸钾(三元的)的稳定的类芽孢杆菌属制剂
[0194]
在54℃下贮存2周后,测试了几种密切相关的化合物稳定类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的潜力。如实施例3中所述,制备和分析样品,且所述样品在类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的70∶30(bc∶水)稀释液中以2%包含脲、磷酸钾(一元的)、磷酸钾(二元的)或柠檬酸钾(三元的)。包括作为对照的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972全肉汤(wb)的样品,然后离心和浓缩。在54℃下贮存2周后,wb对照样品中的抗真菌活性降低了,因此用wb处理过的植物上出现的病害与未处理的植物没有区别(数据未显示)。
[0195]
在54℃下贮存2周后,与脲、磷酸钾(一元的)、磷酸钾(二元的)或柠檬酸钾(三元的)混合的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc样品的抗真菌活性示于表9。浓度(即施用率)是参照处理在水中的稀释度。0%是指与未经处理的对照组相当的效力,而100%的效力是指没有观察到病害。令人惊讶的是,磷酸钾(二元的)稳定了抗真菌活性,而磷酸钾(一元的)却没有。也证实柠檬酸钾(三元的)对类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc具有稳定作用。
[0196][0197]
实施例5.测定溶剂对类芽孢杆菌属制剂的作用
[0198]
类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972在大豆基的培养基上生长,以产生全肉汤培养物。然后将全肉汤培养物离心并浓缩以产生肉汤浓缩物(bc)。如实施例1和2中所述,制备类
芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc在水或丙二醇中的50∶50稀释液,并对其抗真菌活性和相对杀镰孢菌素a水平进行了分析。浓度(即施用率)是参照处理在水中的稀释度。0%是指与未经处理的对照组相当的效力,而100%的效力是指没有观察到病害。
[0199]
在54℃下贮存2周或在40℃下贮存2、4或8周后,在丙二醇中稀释比在水中稀释更大程度地保留了类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的抗真菌活性(比较表10和表11)。此外,在54℃下贮存2周或在40℃下贮存2、4或8周后,在丙二醇中稀释的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc比在水中稀释的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc,杀镰孢菌素a的降解速度更慢(比较图5和6)。
[0200]
[0201]
[0202]
[0203][0204]
实施例6.稳定的类芽孢杆菌属制剂的物理性质的改善
[0205]
制备了类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc并用丙二醇和水的混合物稀释。将稀释的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的一部分与2%的脲混合,其余部分不含脲。
[0206]
如果在延长的时间段内观察到制剂成分几乎没有或没有脱水收缩或沉降,则认为该制剂是物理稳定的。脱水收缩或沉降发生所用的时间越长,制剂在物理上越稳定。如果在54℃下2周后观察到几乎没有或没有脱水收缩或沉降,则该制剂被认为是物理稳定的。
[0207]
稀释的含有或不含脲的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的样品在54℃下贮存2周。贮存前观察到样品的没有脱水收缩或沉降。贮存后样品的照片显示含脲的稀释的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc几乎没有或没有脱水收缩或沉降。相反,不含脲的稀释的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的照片显示制剂分离成不同的层,这表明脱水收缩和沉降。结果表明,由于加入脲,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的物理稳定性得
到改善。
[0208]
实施例7.在23℃下2年后稳定的类芽孢杆菌属制剂的相对杀镰孢菌素a水平和抗真菌活性
[0209]
制备了含有和不含2%脲的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972肉汤浓缩物(bc),在23℃下贮存2年后,如实施例1所述测量了它们对索兰尼链格孢的抗真菌活性。浓度(即施用率)是参照处理在水中的稀释度。0%是指与未经处理的对照组相当的效力,而100%的效力是指没有观察到病害。如实施例2中所述,还测定了肉汤浓缩物中杀镰孢菌素a的相对水平。
[0210]
即使在23℃下贮存2年后,含有2%脲的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的抗真菌活性仍保持在约90%,而不含脲的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的抗真菌活性下降至该水平的一半以下(参见表12)。同样地,在23℃下贮存2年内,含有2%脲的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc中的杀镰孢菌素a水平保持相对恒定,而在相同贮存期内不含脲的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc中的杀镰孢菌素a水平下降至初始水平的约四分之一(参见图8)。
[0211]
实施例8.来自各种类芽孢杆菌属种菌株的稳定制剂中的相对杀镰孢菌素a水平和抗真菌活性
[0212]
如美国专利申请号62/671,067中所记载,类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972与类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306和类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67615有关。类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972是亲本菌株,通过多轮诱变和筛选杀镰孢菌素和杀镰孢菌素样化合物产量增加和液体培养物中粘度降低,从而由其获得其他菌株中的每一种。类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306和类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67615各自在degu和/或degs基因中具有突变,导致固体培养基上的非粘液样菌落形态,以及液体培养物中降低的粘度。
[0213]
制备含脲的类芽孢杆菌属种nrrl b-50972、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304和类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306肉汤浓缩物,在40℃下贮存8周后和在23℃下贮存1年后,如实施例1中所述,测量其对索兰尼链格孢的抗真菌活性。浓度(即施用率)是参照处理在水中的稀释度。0%是指与未经处理的对照组相当的效力,而100%的效力是指没有观察到病害。如实施例2中所述,还测定了肉汤浓缩物中杀镰孢菌素a的相对水平。
[0214]
当以0.625%或0.312%施用于植物时,在40℃下贮存8周后,不含脲的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972bc的抗真菌活性与未处理的对照无显著差异,而各自均与脲混合的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304 bc和类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306 bc的抗真菌活性保持在79%至89%之间(参见表13)。在23℃下贮存1年的肉汤浓缩物观察到了相似的结果,不同的是在这些条件下,可在未处理的对照之上以低水平检测到不含脲的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc的抗真菌活性(参见表14)。
[0215]
在40℃下贮存8周后和在23℃下贮存1年后,各自与脲混合的类芽孢杆菌属种nrrl b-50972 bc、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304 bc和类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306 bc中的杀镰孢菌素a水平保持相对恒定,而在这些相同贮存期内,不含脲的类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-50972 bc中的杀镰孢菌素a水平下降至初始水平的约三分之一(参见图9和图
10)。
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220][0221]
实施例9.类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67304、nrrl b-67306和nrrl b-67615的稳定制剂的相对杀镰孢菌素a水平和抗真菌活性
[0222]
如实施例1中所述,制备类芽孢杆菌属种nrrl b-67304、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306和类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67615的全肉汤和肉汤浓缩物。全肉汤中没有加入脲,而肉汤浓缩物则用脲稳定。在40℃下贮存8周后和在23℃下贮存1年后,如实施例1和3中所述,测量全肉汤和稳定的肉汤浓缩物对灰葡萄孢菌和索兰尼链格孢的抗真菌活性。在抗真菌测定中,全肉汤样品的施用率是肉汤浓缩物样品的两倍,以调整全肉汤中抗真菌化学物质的稀释度。浓度(即施用率)是参照处理在水中的稀释度。0%是指与未经处理的对照组相当的效力,而100%的效力是指没有观察到病害。如实施例2中所述,还测定了全肉汤和肉汤浓缩物中杀镰孢菌素a的相对水平。
[0223]
三种不合脲的类芽孢杆菌属种菌株的全肉汤样品的抗真菌活性与未处理的对照
相似或稍高于未处理的对照。相反,三种类芽孢杆菌属种菌株的脲稳定的肉汤浓缩物的抗真菌活性保持相对地高,且更类似于阳性对照(aso(枯草芽孢杆菌qst713))的抗真菌活性。该阳性对照未经过稳定性测定的贮存条件,并且已知其具有相对高的抗真菌活性。对于两种真菌病原体(即灰葡萄孢菌和索兰尼链格孢)以及在两个时间段内(即在40℃下贮存8周和在23℃下贮存1年),脲的稳定作用均一致(参见表15-18)。
[0224]
在40℃下贮存8周内和在23℃下贮存1年内,类芽孢杆菌属种nrrl b-67304、类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67306和类芽孢杆菌属种菌株nrrl b-67615的全肉汤样品和脲稳定的肉汤浓缩物样品中的杀镰孢菌素a水平分别在图11和图12中示出。尽管不稳定的全肉汤样品中的杀镰孢菌素a水平在这些时间段内显著下降,但含脲的肉汤浓缩物样品中的杀镰孢菌素a水平保持相对恒定。
[0225]
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]
[0232][0233]
除非另外定义,本文中全部技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。所引用的全部出版物、专利和专利出版物因全部目的通过引用全文纳入本文。
[0234]
应理解,所公开的发明不限于所述特定的方法、方案和材料,因为它们能够发生变化。还应理解,本文使用的术语仅出于描述特定的实施方案的目的,并不旨在限制本发明的范围,本发明的范围仅通过所附的权利要求来限定。
[0235]
本领域技术人员仅使用常规实验方法,就将了解或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在被以下权利要求所涵盖。
再多了解一些
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